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文檔簡介
1、背景與目的:細胞周期調(diào)控機制紊亂導致的細胞生長失控被認為是腫瘤發(fā)生的重要機制之一。cyclin E是周期蛋白的一種,它能夠與CDK2一起促進細胞周期的G1/S轉(zhuǎn)換。研究發(fā)現(xiàn)異常情況下,由于cyclin E無順序無規(guī)律的過度表達,cyclin E可持續(xù)存在于整個細胞周期中,不斷激活CDK2和磷酸化pRb,驅(qū)使細胞超越控制機制發(fā)生異常增殖,引起腫瘤的發(fā)生。此外,cyclin E在細胞內(nèi)的積累也會導致染色體的不穩(wěn)定性(chromosome i
2、nstability, CIN),最終引起腫瘤的發(fā)生。研究表明cyclin E的過表達同中心體的高增殖密切相關(guān),提示cyclin E持續(xù)的過表達可引起中心體的異常增殖,擾亂有絲分裂,從而導致早期癌變的發(fā)生。研究表明,cyclin E與肝癌的發(fā)生可能相關(guān)。肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一,我國是肝癌的高發(fā)區(qū),每年發(fā)病人數(shù)超過全世界肝癌死亡人數(shù)的50%,是中國第2位的腫瘤死亡原因
3、。臨床實驗和動物實驗均表明,肝癌患者癌組織中的cyclin E表達增加,而且研究也發(fā)現(xiàn)cyclin E的表達與肝癌的分化程度、侵襲性和臨床分級可能相關(guān)。綜合cyclin E對細胞周期的調(diào)控特點和cyclin E與肝癌之間的關(guān)系,筆者利用RNA干擾技術(shù),通過構(gòu)建轉(zhuǎn)染針對cyclin E的siRNA載體,降低肝癌HepG2細胞中cyclin E的表達水平,觀測降低肝癌組織中cyclin E的表達水平對肝癌細胞生長及細胞周期的影響。
4、 方法:根據(jù)siRNA目標序列的選取原則,設(shè)計并合成2對cyclin E基因靶向siRNA序列的DNA單鏈,退火成雙鏈發(fā)卡樣DNA;將其重組入siRNA載體pGFP-V-RS;得到重組子pGFP-V-RS-siCE951和pGFP-V-RS-siCE1122;對重組子的插入序列進行DNA序列測定,并與設(shè)計序列做同源性比較。利用脂質(zhì)體LipofectAmineTM2000包裹,將pGFP-V-RS-siCE951、pGFP-V-RS-si
5、CE1122和pGFP-V-Con分別轉(zhuǎn)入人肝癌HepG2細胞中,同時設(shè)空白對照組(不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒僅加轉(zhuǎn)染試劑)。RT-PCR和Western-Blot方法檢測各組細胞HepG2mRNA和蛋白表達水平;流式細胞術(shù)檢測各組肝癌細胞的細胞周期,CCK-8試劑檢測細胞的增殖,軟瓊脂克隆形成檢測胞克隆形成能力。
結(jié)果:1.經(jīng)過同源性檢索和優(yōu)選確定951-969位(GCAAAAGG TTTCAGGGTAT)、1122-1140位(GGA
6、CAAAGCCCGAGCAAAG)為siRNA靶序列。
2.篩選得到重組子pGFP-V-RS-siCE951和pGFP-V-RS-siCE1122,測序分析其插入序列與設(shè)計完全一致。
3.干擾1組(轉(zhuǎn)染pGFP-V-RS-siCE951)和干擾2組(轉(zhuǎn)染pGFP-V-RS-siCE1122)細胞cyclin E mRNA的相對表達量分別為0.215±0.021和0.178±0.019,顯著低于空白對照組和無關(guān)siRN
7、A對照組(分別為0.406±0.037和0.372±0.042,p<0.05);在空白對照組與無關(guān)siRNA對照組之間,cyclin E mRNA的相對表達量無顯著性差異(p>0.05)。
4.空白對照組、無關(guān)siRNA對照組、干擾1組和干擾2組細胞在大約54KD處均有免疫印跡出現(xiàn),其中空白對照組和無關(guān)siRNA對照組的免疫印跡顯著強于干擾1組和干擾2組。
5.細胞增殖實驗顯示,干擾1組和干擾2組與空白對照組和無關(guān)s
8、iRNA對照組比較,在3d、4d、5d細胞孔內(nèi)的吸光度值顯著減少,差異有顯著性(p<0.05)。
6.空白對照組與無關(guān)siRNA對照組比較,各期細胞比例無顯著性差異(p>0.05),;干擾1組和干擾2組的各期細胞比例與空白對照組和無關(guān)siRNA對照組比較,S和G2/M期細胞比例減少,GO/G1期細胞比例增加,有顯著性差異(p<0.05)。
7.軟瓊脂集落形成能力實驗顯示,干擾1組和干擾2組平均集落形成數(shù)為124.6±
9、16.3和141.2±15.2,顯著低于無關(guān)siRNA對照組和空白對照組(分別為209.2±25.8和226.7±34.2,p<0.05);空白對照組與無關(guān)siRNA對照組平均集落形成數(shù)比較,差異無顯著性(p>0.05)。
結(jié)論:1. cyclin E951-969位(GCAAAAGGTTTCAGGGTAT)、1122-1140位(GGACAAAGCCCGAGCAAAG)為靶區(qū)段,構(gòu)建的siRNA載體pGFP-V-RS-siC
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