Rb基因在調(diào)控耳蝸支持細胞增殖中的作用及機制.pdf

1、耳蝸毛細胞可將聲波的震動轉(zhuǎn)化為生物電信號，是聽覺系統(tǒng)的關鍵組成部分。但毛細胞極易因噪音、藥物和年齡等因素受損，而哺乳動物的耳蝸毛細胞沒有天然的再生能力，一旦受到損傷，即可造成永久性的聽力喪失。但是在低等的脊椎動物中，毛細胞的損傷可誘導周圍的支持細胞分裂增殖和向毛細胞轉(zhuǎn)分化，最終替代受損毛細胞，維持和恢復感覺上皮的功能，提示支持細胞可能是再生毛細胞的潛在干細胞。最近研究結(jié)果顯示體外分離培養(yǎng)的小鼠耳蝸支持細胞也能夠增殖并向毛細胞轉(zhuǎn)分化，并且

2、該過程中出現(xiàn)了細胞周期抑制因子的下調(diào)，表明在哺乳動物耳蝸內(nèi)，支持細胞也可能具有毛細胞再生潛力，且細胞周期抑制因子的下調(diào)很可能對其重新進入細胞周期的啟動起到重要推動作用。視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(Rb)是細胞周期調(diào)控中起關鍵作用的抑制因子，可以抑制完成細胞周期所需基因的表達。在感覺前體細胞中定向敲除Rb基因，可使前體細胞長時間處于增殖狀態(tài)，并分化出大量毛細胞和支持細胞。但Rb基因在小鼠耳蝸毛細胞內(nèi)定向敲除后，雖然毛細胞也能進入細胞周期，但并不能

3、完成分裂并引起細胞的增殖，反而啟動了細胞凋亡。目前，Rb在耳蝸支持細胞的表達和作用并不明確。本課題通過在出生后的小鼠耳蝸支持細胞內(nèi)定向敲除Rb基因，對哺乳動物耳蝸支持細胞在毛細胞再生中的潛能進行研究，以期為耳蝸毛細胞再生的機制研究和臨床治療提供更有效的方案。
　　課題主要研究方法和內(nèi)容如下：
　　一、分析Prox1-CreERT2小鼠系在耳蝸內(nèi)的Cre重組酶活性。
　　(1)建立檢測Cre重組酶活性的指示模型小鼠。①將

4、Prox1-CreERT2小鼠與Rosa-LacZ指示小鼠相雜交，獲取Prox1-CreERT2/ROSA-LacZ小鼠，從而在具有Cre重組酶活性的細胞中表達β-半乳糖酐酶(β-gal)。②通過X-gal染色，檢測耳蝸中的β-gal活性，從而顯示Prox1-CreERT2小鼠耳蝸中具有Cre重組酶活性的細胞。
　　(2)誘導Cre重組酶活性。分別在P0和P1，按每日1次，每次3mg/40g體重劑量，對新生的Prox1-CreER

5、T2/ROSA-LacZ小鼠進行腹腔注射tamoxifen。
　　(3)檢測經(jīng)tamoxifen誘導后的Prox1-CreERT2小鼠耳蝸內(nèi)，Cre重組酶活性的分布情況。①對新生的Prox1-CreERT2/ROSA-LacZ小鼠進行腹腔注射tamoxifen，時間和劑量同上，以誘導Cre重組活性。②對接受過tamoxifen注射的Prox1-CreERT2/ROSA-LacZ小鼠，在P6采集其耳蝸進行冰凍切片和耳蝸鋪片，利用X-

6、gal染色并結(jié)合毛細胞特異性標記抗體Myo7a的雙重染色，以顯示具有Cre重組酶活性的細胞及其相對于耳蝸毛細胞的位置。
　　(4)Cre重組酶活性在不同支持細胞亞型中的分布情況。①將Prox1-CreERT2小鼠與Rosa-EYFP指示小鼠相雜交，獲取Prox1-CreERT2/ROSA-EYFP小鼠，從而在具有Cre重組酶活性的細胞中表達增強的黃色熒光蛋白(EYFP)。②對Prox1-CreERT2/ROSA-EYFP小鼠進行t

7、amoxifen腹腔注射，時間和劑量同上，以誘導Cre重組活性。⑨對接受過tamoxifen注射的Prox1-CreERT2/ROSA-EYFP小鼠，在P4采集耳蝸，制作鋪片，利用免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡的三維重建技術(shù)，觀察耳蝸內(nèi)表達EYFP的細胞，并分析其與毛細胞和支持細胞的關系，使EYFP陽性細胞的細胞類型得到進一步確定。
　　二、分析新生小鼠耳蝸支持細胞在失去Rb作用后的增殖潛能。
　　(1)建立耳蝸支持細胞中定向敲

8、除Rb基因的小鼠模型。①將Prox1-CreERT2小鼠與RbloxP/loxP小鼠雜交，獲取Prox1-CreERT2/RbloxP/loxP小鼠。②分別于P0和P1腹腔注射tamoxifen，劑量同前，以誘導Prox1-CreERT2/RbloxP/loxP小鼠體內(nèi)發(fā)生Cre重組酶介導的肋基因敲除。
　　(2)檢測耳蝸支持細胞失去Rb作用后是否重新進入了細胞周期。①接受過tamoxifen注射的Prox1-CreERT2/Rb

9、loxP/loxP小鼠(即Prox1-Rb-/-小鼠)，在P4或P6對其進行BrdU或EdU的腹腔注射，以標記此時重新進入細胞周期的耳蝸支持細胞。②通過免疫熒光染色(適用于BrdU)或共價疊氮反應(適用于EdU)，并結(jié)合毛細胞或支持細胞特異性標記蛋白的雙重熒光染色，檢測重新進入細胞周期的耳蝸支持細胞。③在Prox1-Rb-/-耳蝸頂、中、底回的相應位置，分別對BrdU陽性支持細胞進行計數(shù)統(tǒng)計。④將Prox1-Rb-/-耳蝸內(nèi)增殖性的支持

10、細胞分布，與Prox1-CreERT2乃小鼠耳蝸內(nèi)Cre重組酶的分布情況進行比較與分析。
　　(3)檢測耳蝸支持細胞失去Rb作用后是否可以完成細胞周期并增殖。①檢測Prox1-Rb-/-耳蝸內(nèi)BrdU陽性細胞的染色質(zhì)凝集現(xiàn)象，以及其支持細胞pH3的分子表達情況，以研究通過限制點和S期的Prox1-Rb-/-耳蝸支持細胞能否進入M期。②在Prox1-Rb-/-耳蝸內(nèi)進行BrdU和FISH(可檢測DNA處于已被復制狀態(tài)還是未被復制狀態(tài)

11、)的雙重染色，以研究重新進入細胞周期的支持細胞是否可以完成有絲分裂。③對Prox1-Rb-/-小鼠進行BrdU和EdU的雙重標記，以研究Rb基因缺陷的耳蝸支持細胞是否具有多次進入細胞周期的潛能。④通過外指細胞和柱細胞的計數(shù)統(tǒng)計，以研究失去Rb作用的耳蝸支持細胞是否真正產(chǎn)生了增殖反應。
　　三、研究Rb基因缺陷的耳蝸支持細胞在增殖后的分化和存活情況。
　　(1)觀察Prox1-Rb-/-小鼠耳蝸中的細胞凋亡情況。①對不同日齡的

12、Prox1-Rb-/-小鼠耳蝸進行TUNEL染色，以檢測最早出現(xiàn)凋亡的時間和支持細胞亞型。②在P9對Prox1-Rb-/-小鼠耳蝸鋪片中的TUNEL，陽性細胞進行統(tǒng)計，并與對照組比較以了解Rb基因缺陷的支持細胞凋亡情況。③對不同日齡Prox1-Rb-/-小鼠耳蝸鋪片進行Myo7a或Myo6免疫熒光染色，以檢測毛細胞數(shù)量是否受到影響。
　　(2)研究Rb基因缺陷的耳蝸支持細胞在增殖后的細胞分化命運。①分別在P4-P5或P8-P14每

13、日1次對Prox1-Rb-/-小鼠進行EdU的腹腔注射，通過EdU染色結(jié)合毛細胞和/或支持細胞特異性標記蛋白Myo6、Prox1和Sox2的多重熒光染色，以檢測Rb基因缺陷的支持細胞在增殖過程中的分化命運。②研究在耳蝸內(nèi)出現(xiàn)繼發(fā)性毛細胞丟失的情況下，其分化是否會受到影響，探討如何對哺乳動物耳蝸支持細胞進行適當?shù)恼{(diào)控，可以使其對毛細胞再生發(fā)揮最大的潛能。
　　主要結(jié)果如下：
　　(1)新生的Prox1-CreET2乃小鼠耳蝸支

14、持細胞可定向誘導Cre重組酶活性。
　　分別在P0和P1，按3mg/40g體重劑量腹腔注射tamoxifen，Prox1-CreERT2小鼠耳蝸中Cre重組酶的活性局限于外指細胞和柱細胞內(nèi)。而且，具有重組酶活性的細胞數(shù)量從耳蝸底回至頂回呈逐漸上升的趨勢。在Prox1-CreERT2/ROSA-EYFP小鼠耳蝸頂回的EYPF陽性細胞中，外指細胞和柱細胞分別為72.77％±1.12％和27.23％±1.12％，即具有Cre重組酶活性的

15、支持細胞大多為外指細胞。
　　(2)Rb基因的敲除可引起耳蝸支持細胞重新進入細胞周期并增殖。
　　在Prox1-Rb-/-小鼠耳蝸內(nèi)，發(fā)現(xiàn)外指細胞和柱細胞部位有BrdU陽性細胞出現(xiàn)。在毛細胞分布的位置有時也會發(fā)現(xiàn)BrdU陽性細胞，但這些細胞都表達支持細胞抗原Prox1，而不表達毛細胞抗原Myo7a。從耳蝸底回至頂回，BrdU陽性支持細胞的數(shù)量呈漸增的趨勢。在P4時，BrdU陽性的柱細胞數(shù)量明顯多于外指細胞。至P6時，與對照組

16、相比，Rb基因缺失后支持細胞數(shù)量明顯增多。
　　Rb基因缺失的外指細胞和柱細胞都可進入細胞有絲分裂期(M期)，表達M期特有的蛋白和具有M期特征性的凝集染色質(zhì)。在P6的BrdU陽性柱細胞，發(fā)現(xiàn)其僅含2個FISH信號點，顯示G1期或早期S期的特征，表明其重新進入細胞周期后已完成了細胞分裂。在Prox1-Rb-/-耳蝸中還發(fā)現(xiàn)有BrdU/EdU雙重染色陽性的柱細胞存在，提示其具有進行多次細胞分裂的潛能。
　　(3)Rb基因敲除后耳

17、蝸支持細胞的細胞凋亡。
　　在P5之前的Prox1-Rb-/-耳蝸切片上，并未見到Corti器內(nèi)出現(xiàn)TUNEL陽性的支持細胞，而在P7的Prox1-Rb-/-耳蝸鋪片上，我們首先觀察到了Corti器中的凋亡細胞。從TUNEL染色陽性細胞位置推測，這些最早出現(xiàn)死亡信號的細胞很可能是那些細胞核遷移至毛細胞層的外指細胞。之后Prox1-Rb-/-小鼠耳蝸繼發(fā)毛細胞死亡，其毛細胞數(shù)量在P9并未發(fā)生顯著改變，但在P12的耳蝸頂回可見零星的毛

18、細胞丟失，在出生后7周的耳蝸鋪片上可見更嚴重的毛細胞丟失。并且在P12和P21耳蝸項回的毛細胞丟失比底回更嚴重。5周齡的Prox1-Rb-/-小鼠聽性腦干反應(ABR)測試顯示聽閾上升，聽覺能力明顯低于對照組。
　　(4)Rb基因缺陷的外指細胞和柱細胞在增殖過程中仍保持支持細胞命運。
　　在P4時，Prox1-Rb-/-耳蝸所有EdU陽性細胞均可被Prox1和Sox2所標記，證實了增殖中的Rb基因缺陷的支持細胞在重新進入細胞