Tγδ1和Tγδ17細(xì)胞在結(jié)核分枝桿菌感染中的免疫作用.pdf

1、研究背景：全球目前有近三分之一的人口感染了結(jié)核分枝桿菌（Mtb)，其中5~10％可發(fā)展為結(jié)核?。═B)，而且 TB仍是近年來(lái)世界上因感染單一病原體而死亡的最重要病因之一。如何快速診斷出結(jié)核病是治療結(jié)核、控制結(jié)核的重點(diǎn)項(xiàng)目之一。檢測(cè)結(jié)核桿菌感染的試劑盒（T-SPOT-TB)根據(jù)免疫應(yīng)答及回憶反應(yīng)的原理，用 ESAT6/CFP10刺激 CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生 IFN-γ，但這種試劑盒不能區(qū)分Mtb隱匿性感染者(以下簡(jiǎn)稱(chēng)隱感者)與 TB患者。近年

2、已證實(shí)了γδT細(xì)胞在結(jié)核感染中的免疫作用。γδT細(xì)胞對(duì) Mtb抗原的刺激有增殖反應(yīng)并產(chǎn)生 IFN-γ。與正常人（HD)或隱感者相比，TB患者γδT細(xì)胞對(duì) Mtb抗原刺激后的增殖反應(yīng)降低，而γδT細(xì)胞產(chǎn)生 IFN-γ（Tγδ1細(xì)胞)的能力有何不同尚不清楚。已報(bào)道不同細(xì)胞因子可誘導(dǎo)小鼠γδT細(xì)胞產(chǎn)生 IL-17（Tγδ17細(xì)胞)。但誘導(dǎo)人γδT細(xì)胞產(chǎn)生 IL-17的調(diào)控機(jī)制以及 Mtb抗原的影響，也還有待探討。
　　目的：檢測(cè) HD，

3、TB患者經(jīng)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）培養(yǎng)增殖后用Mtb-HAg刺激后 T細(xì)胞亞群產(chǎn)生 IFN-γ和 IL-17的變化。觀察不同細(xì)胞因子和Mtb抗原在誘導(dǎo)γδT細(xì)胞產(chǎn)生 IL-17中的作用。以闡明隱感者和 TB患者之間γδT細(xì)胞的天然和特異性免疫的差異，以及為 TB患者不同病程期間的免疫功能狀態(tài)提供新的判定指標(biāo)。
　　方法：1.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) Mtb-Ag刺激γδT細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ
　　1.1采集3例 HD外周血，加入

4、 Mtb-HAg刺激培養(yǎng)10h，14h，18h后，再加入莫能霉素（Monensin）繼續(xù)培養(yǎng)6h，收集細(xì)胞，加入熒光標(biāo)記單抗進(jìn)行表面分子和胞內(nèi)染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)產(chǎn)生 IFN-γ的T細(xì)胞亞群比例。
　　1.2采集隱感者和 TB患者外周血，分別用磷酸化抗原 HDMAPP、Mtb-HAg和 Mtb-HAg(10K)刺激培養(yǎng)14h，再加入莫能霉素（Monensin）繼續(xù)培養(yǎng)6 h，收集細(xì)胞，加入熒光標(biāo)記單抗進(jìn)行表面分子和胞內(nèi)染色，流式細(xì)

5、胞儀檢測(cè)產(chǎn)生IFN-γ的T細(xì)胞亞群比例。
　　1.3收集 HD和 TB患者外周血分離 PBMC經(jīng)培養(yǎng)增殖12天后的細(xì)胞，用或不用 Mtb-HAg刺激培養(yǎng)2 h，再加入莫能霉素（Monensin）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集細(xì)胞，加入熒光標(biāo)記單抗進(jìn)行表面分子和胞內(nèi)染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)γδT細(xì)胞中產(chǎn)生 IFN-γ和 IL-17細(xì)胞的相對(duì)比例。
　　2. ELISPOT方法檢測(cè)隱感者和 TB外周血 T細(xì)胞亞群產(chǎn)生 IFN-γ和IL-17<

6、br>　　2.1運(yùn)用結(jié)核桿菌感染 T細(xì)胞酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)診斷試劑盒從 HD人群中篩選隱感者，采集HD外周血分離 PBMC調(diào)整細(xì)胞數(shù)，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)每孔加入細(xì)胞懸液將 ELISPOT板置于37℃培養(yǎng)20 h后，進(jìn)行洗滌孵育顯色，最后進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，每10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中產(chǎn)生 IFN-γ細(xì)胞數(shù)。
　　2.2采集隱感者和TB患者外周血分離 PBMC，取一部分細(xì)胞進(jìn)行免疫磁珠的分選收集無(wú)γδT細(xì)胞（γδˉ）的PBMC，再將這兩部分細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞數(shù)按實(shí)驗(yàn)

7、設(shè)計(jì)每孔加入細(xì)胞懸液將 ELISPOT板置于37℃培養(yǎng)20h后，進(jìn)行洗滌孵育顯色，最后進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，每10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中產(chǎn)生IFN-γ和IL-17細(xì)胞數(shù)。
　　3. Mtb-Ag和細(xì)胞因子(CK)對(duì)γδT細(xì)胞激活誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-17和IL-17﹢IL-22﹢
　　采集 HD外周血分離 PBMC，加入 Mtb-HAg、HDMAPP、Mtb-SoAg和細(xì)胞因子（IL-1β、TGF-β）培養(yǎng)3天后，加入 rIL-2刺激培養(yǎng)，第9天加

8、入 IL-23繼續(xù)培養(yǎng)至12天，使其成為富含效應(yīng)性γδT細(xì)胞的細(xì)胞群，收集細(xì)胞用PMA/Ionomycin和 Monensin刺激培養(yǎng)6h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)產(chǎn)生 IL-17和 IL-17+IL-22+的γδT細(xì)胞亞群比例。
　　結(jié)果：1. Mtb-HAg刺激 HD外周血（n＝3）第16 h開(kāi)始，γδT細(xì)胞中產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞逐漸增多，至20 h時(shí)和24 h時(shí)，分別為3.33%和3.50%。
　　2、用 Mtb感染 T細(xì)胞診斷

9、 ELISPOT試劑盒檢測(cè)從 HD人群中篩選隱感者，利用判定陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)從17例 HD人群中篩選出11例隱感者。
　　3、隱感者經(jīng)不同抗原刺激20h后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，αβT細(xì)胞和γδT細(xì)胞均能產(chǎn)生 IFN-γ，而產(chǎn)生 IFN–γ的γδT細(xì)胞比αβT細(xì)胞多。αβT細(xì)胞和γδT細(xì)胞中 IFN-γ+細(xì)胞比率在 HDMAPP刺激組（n＝6）（0.45%和7.42%），Mtb-HAg刺激組（n＝11）（0.42％和5.63％），Mtb-H

10、Ag(10K)組（n＝8）（0.61％和7.6％）中比較，均有明顯差異（p<0.05）。 TB患者經(jīng)不同抗原刺激20h后，γδT細(xì)胞中產(chǎn)生 IFN-γ細(xì)胞也比αβT細(xì)胞中的多。在 HDMAPP刺激組（n＝6）（2.0%，3.35%）， Mtb-HAg刺激組（n＝12）（0.87％和2.11％），Mtb-HAg(10K)組（n＝10）（0.64％和2.35％）。各實(shí)驗(yàn)組中αβT細(xì)胞和γδT細(xì)胞中 IFN-γ+細(xì)胞比率的比較均有明顯差異（p

11、<0.05）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)， Mtb-HAg刺激后 TB患者γδT細(xì)胞中 IFN-γ產(chǎn)生細(xì)胞的比例顯著低于隱感者。
　　4、運(yùn)用 ELISPOT方法檢測(cè)隱感者（n＝11）和 TB（n＝11）患者 IFN-γ和 IL-17兩種細(xì)胞因子，隱感者和 TB患者比較，經(jīng) PHA刺激， IFN-γ和IL-17兩種細(xì)胞因子， TB患者比隱感者產(chǎn)生的要少，兩者有明顯差異 p<0.05。
　　5、HD和 TB患者經(jīng) PBMC培養(yǎng)增殖12天，

12、用 Mtb-HAg再刺激用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)γδT細(xì)胞 IFN-γ+細(xì)胞比率。 HD和 TB患者用或不用 Mtb-HAg再刺激檢測(cè) IFN-γ比較有差異顯著性 p<0.05。
　　6、不同抗原刺激和極化培養(yǎng) Tγδ17細(xì)胞的比較，Mtb-HAg+CK組比Mtb-HAg組明顯升高，兩組有明顯差異（p<0.05），HDMAPP+CK組比HDMAPP組明顯升高，兩組有明顯差異（p<0.05）， Mtb-SoAg和Mtb-SoAg+CK組則無(wú)

13、差異性。
　　結(jié)論：1. Mtb-HAg刺激 HD外周血γδT細(xì)胞產(chǎn)生 IFN-γ的最適時(shí)間是20h。
　　2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明， Mtb-HAg刺激后隱感者和 TB患者的外周γδT細(xì)胞中產(chǎn)生 IFN-γ的細(xì)胞均顯著高于αβT細(xì)胞。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)和 ELISPOT檢測(cè)均表明，隱感者γδT細(xì)胞中產(chǎn)生 IFN-γ細(xì)胞均比 TB患者的高。
　　4.免疫磁珠負(fù)選法和 ELISPOT檢測(cè)初步表明隱感者γδT細(xì)胞

14、中產(chǎn)生IL-17細(xì)胞比 TB患者的高。
　　5. HD和 TB患者經(jīng) PBMC培養(yǎng)增殖后，經(jīng) Mtb-HAg刺激后γδT細(xì)胞中產(chǎn)生 IFN-γ的細(xì)胞明顯增多，而產(chǎn)生 IL-17細(xì)胞經(jīng)刺激后是下降的。
　　6. HD外周血分離 PBMC， Mtb-HAg、磷酸抗原（HDMAPP）激活γδT細(xì)胞同時(shí)加入含誘導(dǎo)性細(xì)胞因子（IL-1β，TGF-β，IL-23），可誘導(dǎo) Tγδ17細(xì)胞的分化和增殖，而 Mtb-SoAg則不能有效的誘導(dǎo)