PD-1Ig編碼質(zhì)粒對(duì)TRP-2肽疫苗治療小鼠B16F10黑素瘤的影響及其機(jī)制.pdf

1、惡性黑素瘤是惡性程度最高的皮膚腫瘤，臨床上迫切需要新型的治療策略。治療性疫苗作為一種極具發(fā)展前景的生物治療方法，目前臨床有效率仍較低。PD-L1：PD-1負(fù)性調(diào)節(jié)通路參與了惡性黑素瘤的免疫逃逸，本研究探討利用注射PD-1Ig編碼質(zhì)粒阻斷該通路以提高TRP-2肽疫苗治療小鼠黑素瘤治療效應(yīng)的可能性，并在TRP-2180-188特異性CD8+T細(xì)胞水平分析其作用機(jī)制。 第一部分PD-1Ig編碼質(zhì)粒的構(gòu)建與大規(guī)模制備目的構(gòu)建并大規(guī)模制備

2、PD-1Ig編碼質(zhì)粒，為后續(xù)研究創(chuàng)造條件。方法：用TMpred軟件和UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)小鼠PD-1胞外域，RT-PCR克隆其編碼序列，構(gòu)建PD-1Ig編碼質(zhì)粒：測(cè)序驗(yàn)證后，分別應(yīng)用ELISA和RT-PCR方法檢測(cè)其體內(nèi)外表達(dá)情況；最后應(yīng)用QIAGEN EndoFree PlasmidGiga Kit大規(guī)模制備pPD-1Ig質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒pig-tail。結(jié)果預(yù)測(cè)小鼠PD-1分子殘基1-20為信號(hào)肽，殘基169-170為跨

3、膜結(jié)構(gòu)的起點(diǎn)可能性大。成功擴(kuò)增小鼠PD-1胞外域(殘基21-168)的編碼基因，并克隆至pIg-tail中。pPD-1Ig和pig-tail質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染B16F10細(xì)胞，ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中PD-1Ig和Ig-tail濃度分別為17.53 ng/mL和21.8l ng/mL。注射pPD-1Ig和plg-tail質(zhì)粒1d、3d后均擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的DNA片段。結(jié)論成功構(gòu)建了pPD-1Ig真核表達(dá)載體，證實(shí)其能在體內(nèi)外表達(dá)，并為后續(xù)

4、研究大規(guī)模制備了pPD-1Ig和pig-tail質(zhì)粒。 第二部分 pPD-1Ig對(duì)小鼠黑素瘤TRP-2肽疫苗治療效應(yīng)的影響目的探討pPD-1Ig對(duì)小鼠黑素瘤TRP-2180-188肽疫苗治療效應(yīng)的影響。方法：以小鼠B16F1O黑素瘤皮下移植瘤為模型，以未治療組、單用TRP-2180-188肽疫苗組、TRP-2180-188肽疫苗聯(lián)合pig-tail質(zhì)粒組為對(duì)照，以成瘤率、腫瘤生長(zhǎng)速度、生存曲線為觀察指標(biāo)，研究了pPD-1Ig對(duì)T

5、RP-2180-188肽疫苗治療的影響。結(jié)果與單用TRP-2180-188肽疫苗組相比，聯(lián)合應(yīng)用pPD-1Ig能顯著推遲B16F10皮下移植瘤的形成(中位天數(shù)：10 vs 13，P=0.0354)、抑制其生長(zhǎng)(D16，D19時(shí)腫瘤大小的中位數(shù)為：39.43 vs 13.74 mm2，90.83 vs 38.83 mm2。P值分別為0.0102，0.0029)，并延長(zhǎng)荷瘤小鼠的存活(中位生存時(shí)間：25 d vs 29.5 d,(P=0.0

6、349)。另外，自D16開(kāi)始，TRP-2肽疫苗聯(lián)合pPD-1Ig組小鼠皮下移植瘤也明顯小于TRP-2肽疫苗聯(lián)合pIg-tail組(D16，D19時(shí)腫瘤大?。?3.74 vs 31.19mm2，38.83 vs 59.47 mm2； P值分別為0.0120，0.0141)。 結(jié)論應(yīng)用pPD-1Ig阻斷PD-1負(fù)性信號(hào)通路，可顯著增強(qiáng)TRP-2180-188肽疫苗治療小鼠黑素瘤的療效。 第三部分 pPD-1Ig對(duì)TRP-2肽疫苗治療

7、效應(yīng)影響的機(jī)制分析目的在TRP-2特異性CD8+T細(xì)胞水平，分析pPD-1Ig對(duì)TRP-2肽疫苗治療效應(yīng)影響的機(jī)制。方法：制備H-2KbTRP-2/SVY四聚體，通過(guò)應(yīng)用該四聚體，結(jié)合相應(yīng)熒光抗體，對(duì)TRP-2特異性CD8+T細(xì)胞的頻率、PD-1表達(dá)、CD62L，CD127表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果 (1)成功制備H-2Kb TRP-2/SVY四聚體；(2)TRP-2180-188肽疫苗聯(lián)合pPD-1Ig組小鼠外周血TRP-2/SVY特異性

8、CD8+T細(xì)胞頻率，在D11和D25均顯著高于單用TRP-2180-188肽疫苗組(P值均<0.05)，與聯(lián)合應(yīng)用pIg-tail組相比雖然頻率有所增加，但差異并無(wú)顯著性(P值均>0.05)。(3)各免疫治療組小鼠外周血TRP-2/SVY特異性CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)率在免疫治療D25時(shí)較D11時(shí)均顯著升高(P值均<0.01)，但在各治療組之間，其表達(dá)并無(wú)顯著性差異(P值均>0.05)。 (4)免疫治療D11時(shí)，pPD-1Ig使接受T

9、RP-2180-188肽疫苗治療小鼠外周血TRP-2抗原特異性CD8+T細(xì)胞中的效應(yīng)T細(xì)胞(Teff細(xì)胞，CD62L-CD127-)比例增高，中央型記憶T細(xì)胞(Tcm細(xì)胞，CD62L+CD127+)比例降低(P值均<0.05)，但效應(yīng)型記憶T細(xì)胞(Tem細(xì)胞，CD62L+CD127-)比例無(wú)顯著變化(P>0.05)。但免疫治療D25時(shí)，各治療組間外周血TRP-2抗原特異性CD8+T細(xì)胞中Teff、Tem、Tcm細(xì)胞所占比例并無(wú)顯著差異(