人組織因子途徑抑制物-2的結構1,3和C端的表達、純化和結構功能研究.pdf

1、組織因子途徑抑制物—2(tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2),是一種帶有kunitz型結構域的蛋白酶抑制劑。成熟的hTFPI-2(human TFPI-2)由富含酸性氨基酸的N端、串聯(lián)的三個kunitz結構域和富含堿性氨基酸的C端組成。體外實驗發(fā)現(xiàn)它能抑制胰蛋白酶、纖溶酶、糜蛋白酶、血漿緩激肽釋放酶、胰凝乳蛋白酶、組織蛋白酶G等多種蛋白酶的活性。研究表明hTFPI-2能夠抑制乳腺癌、前列腺癌

2、、肺癌、纖維肉瘤、黑色素瘤、膠質細胞瘤等多種惡性腫瘤的侵襲轉移,也能夠抑制動脈粥樣硬化斑塊的脫落。因此,hTFPI-2有可能作為一種新型蛋白質藥物,在治療腫瘤轉移和動脈粥樣硬化并發(fā)癥方面具有潛在的應用前景。但目前對hTFPI-2結構功能的了解還不十分清楚,極大地妨礙了它的應用。
　　 第一個結構域(hTFPI-2/KD1)是hTFPI-2發(fā)揮對多種蛋白酶抑制活性的關鍵部位。所以對hTFPI-2/KD1的結構,功能及其關系的研究顯

3、得尤為重要。本論文利用傅立葉紅外光譜、圓二色譜和拉曼光譜研究了hTFPI-2/KD1的二級結構。發(fā)現(xiàn)hTFPI-2/KD1含有約17％α-螺旋,24％β-伸展鏈,46％無規(guī)卷曲,13％的β-轉角結構,以及ggg和tgt兩種結構的二硫鍵。通過對hTFPI-2/KD1的光譜隨溫度變化情況的研究,我們發(fā)現(xiàn)hTFPI-2/KD1具有一定的熱穩(wěn)定性。在高溫下hTFPI-2/KD1可以轉變?yōu)橐环N中間態(tài),當溫度降低后又變回到正常構型。對hTFPI-2

4、/KD1的生物學活性實驗也證實了hTFPI-2/KD1在80℃下孵育5 min再恢復到室溫后,仍保持了原有抑制纖溶酶的活性。
　　 本論文還探索了采用酵母表達系統(tǒng)制備hTFPI-2第三個Kunitz結構域及C端(hTFPI-2/KD3C)的工藝路線。在突變了糖基化位點,并按照畢赤酵母密碼子使用的偏好性優(yōu)化了hTFPI-2/KD3C的編碼基因的基礎上,將優(yōu)化的基因與畢赤酵母表達載體pPIC9K重組,用電轉化的方法使重組質粒轉入畢赤

5、酵母體內,篩選出高拷貝的轉化子。經發(fā)酵、表達和純化后的目的蛋白純度達到97％,產量為25mg/L左右。
　　 在得到高純度的hTFPI-2/KD3C樣品后,本文首次在Bruker DMX500兆核磁共振儀上進行了hTFPI-2/KD3C的1H NMR實驗,初步探討了其結構和功能。利用hTFPI-1/KD3C與hTFPI-2/KD3C的高度同源性,我們從hTFPI-1/KD3C的已知結構功能入手,探討了hTFPI-2/KD3C的結