椎旁肌力量失衡雙足鼠脊柱側(cè)凸模型的建立及其相關(guān)研究.pdf

1、脊柱側(cè)凸是一種脊柱三維畸形，通常伴有椎體旋轉(zhuǎn)，嚴(yán)重影響嬰幼兒及青少年身心健康。建立理想的脊柱側(cè)凸動物模型是探索其發(fā)病機(jī)制、治療手段的重要方法，同時為特發(fā)性脊柱側(cè)凸的深入研究提供參考。制造特發(fā)性脊柱側(cè)凸動物模型是一個巨大的挑戰(zhàn)，因?yàn)楦鶕?jù)特發(fā)性定義幾乎不可能制造出一個缺乏已知病因的動物模型，只能通過對脊柱及其周圍結(jié)構(gòu)盡量少的干擾，制造出在三維形態(tài)上、影像學(xué)上、組織學(xué)上發(fā)展規(guī)律與人特發(fā)性脊柱側(cè)凸盡可能相似的實(shí)驗(yàn)動物，為進(jìn)一步研究提供線索和幫助

2、。但至今尚沒有一種動物模型能滿足以上要求。盡管如此，學(xué)者們對脊柱側(cè)凸動物模型的研究熱情絲毫未減。
　　 在研究褪黑素與脊柱側(cè)凸的關(guān)系中，使用的實(shí)驗(yàn)動物是雞和雙足鼠或四足鼠；通過電刺激椎旁肌和切除肋間神經(jīng)建立脊柱側(cè)凸模型的動物常使用鼠和兔；通過切除肋骨、栓系椎骨或肋骨等方法建立脊柱側(cè)凸模型的動物有：兔、羊、豬、牛等。最近發(fā)現(xiàn)：彎背突變株古比魚在生長發(fā)育過程中可出現(xiàn)脊柱側(cè)凸及后凸等畸形，認(rèn)為通過對古比魚的基因組研究，可能對人類脊柱畸

3、形研究提供重要參考。
　　 大鼠脊柱側(cè)凸模型的研究一直是學(xué)者們關(guān)注的焦點(diǎn)，由于雙足鼠可雙足行走和豎直站立，與人類生物力學(xué)相似；同時大鼠具有價格低廉、造模時間短等優(yōu)點(diǎn)，因此雙足鼠動物模型被越來越多的學(xué)者接受。國內(nèi)不少學(xué)者通過栓系雙足鼠肋骨或肩胛骨與髂骨建立脊柱側(cè)凸模型。然而，目前文獻(xiàn)報道的造模方法存在明顯不足，如模型動物與人類種屬差異太大、不能模擬人類直立姿勢、模型椎體無明顯旋轉(zhuǎn)、通過栓系等途徑破壞脊柱及椎旁肌的完整性、模型側(cè)凸范

4、圍過大等。
　　 椎旁肌是人體軀干姿勢反射弧的效應(yīng)器，與脊柱側(cè)凸關(guān)系密切，椎旁肌病變會影響脊柱的序列變化。特發(fā)性脊柱側(cè)凸具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，椎旁肌異常是否是特發(fā)性脊柱側(cè)凸的致病因素一直存在爭議。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，A型肉毒毒素(BTX-A)通過阻斷膽堿能神經(jīng)末端的鈣離子通道，進(jìn)而阻止突觸前膜乙酰膽堿的釋放，阻斷神經(jīng)沖動的傳遞，起到了化學(xué)去神經(jīng)作用，最終造成肌肉無法收縮，出現(xiàn)局部肌肉麻痹無力。就此特性，若將BTX-A注射至

5、雙足鼠一側(cè)椎旁肌，致兩側(cè)椎旁肌肌力不均衡，是否能夠建立脊柱側(cè)凸模型?合理的BTX-A劑量又該多大?本課題就這些問題做深入研究。
　　 實(shí)驗(yàn)第一部分：BTX-A椎旁肌注射建立雙足鼠脊柱側(cè)凸模型及BTX-A的安全劑量研究
　　 目的：探討B(tài)TX-A椎旁肌注射是否能夠建立雙足鼠脊柱側(cè)凸模型及明確BTX-A有效的安全劑量。
　　 方法：將56只4周齡雌性SD大鼠隨機(jī)分A、B、C、D、E、F、G組，每組8只。首先，所有大鼠

6、截除雙上肢建立雙足鼠模型，術(shù)后即刻予高籠喂養(yǎng)。3天后，A-F組大鼠椎旁肌右側(cè)區(qū)域注射不同濃度的BTX-A，G組為對照組，注射等量生理鹽水，觀察各組大鼠生命體征2周，2周后存活大鼠行X線片檢查。
　　 結(jié)果：雙足鼠模型全部建立成功，大鼠麻醉蘇醒后可豎直站立取水。雙足鼠右側(cè)椎旁肌注射不同劑量的BTX-A后，注射12.5U/100g及以上劑量的大鼠于一周內(nèi)相繼死亡，注射6.25U/100g及以下劑量的大鼠全部存活。注射后2周X線提示雙

7、足鼠出現(xiàn)脊柱側(cè)凸，并凸向注射側(cè)。E組大鼠的側(cè)凸Cobb角大于F組大鼠。
　　 結(jié)論：BTX-A一側(cè)椎旁肌注射可成功建立雙足鼠脊柱側(cè)凸模型，6.25U/100g是大鼠有效的安全劑量。
　　 實(shí)驗(yàn)第二部分：雙足鼠注射6.25U/100g劑量的BTX-A后椎旁肌顯微結(jié)構(gòu)及相關(guān)蛋白研究
　　 目的：通過A型肉毒毒素(BTX-A)注射于雙足鼠一側(cè)椎旁肌建立脊柱側(cè)凸模型，研究雙足鼠椎旁肌顯微結(jié)構(gòu)及相關(guān)蛋白表達(dá)變化。
　

8、　 方法：將36只4周齡雌性SD大鼠隨機(jī)分A、B兩組，每組18只。首先，所有大鼠截除雙上肢建立雙足鼠模型，術(shù)后即刻予高籠喂養(yǎng)。3天后，A組大鼠椎旁肌右側(cè)區(qū)域注射6.25U/100g劑量的BTX-A，B組為對照組，注射等量生理鹽水。3周、6周、9周后，在麻醉下切開大鼠胸背部皮膚，取雙側(cè)椎旁肌肌肉標(biāo)本，行光鏡、電鏡檢查，Western blot方法檢測大鼠椎旁肌鈣調(diào)蛋白含量，抽取大鼠靜脈血，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)檢測褪黑素水

9、平。
　　 結(jié)果：雙足鼠右側(cè)椎旁肌注射BTX-A，脊柱側(cè)凸模型建立成功。肉眼下可見大鼠注射BTX-A的部位肌肉明顯萎縮，大鼠脊柱向注射側(cè)側(cè)凸，光鏡發(fā)現(xiàn)注射側(cè)肌肉萎縮，肌肉橫截面積較對側(cè)及對照組明顯減小，電鏡下囊泡數(shù)量極少，線粒體損傷，核染色質(zhì)不均勻，部分區(qū)域肌絲破壞，未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)肌肉接頭。注射BTX-A9周后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠注射側(cè)肌肉萎縮明顯減輕，電鏡下各細(xì)胞器形態(tài)結(jié)構(gòu)部分恢復(fù)。各時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對照組血清褪黑素水平無明顯差異，注射側(cè)

10、鈣調(diào)蛋白表達(dá)較正常對照組輕度升高，而實(shí)驗(yàn)組未注射側(cè)鈣調(diào)蛋白的表達(dá)較注射側(cè)及正常對照組均明顯下降。
　　 結(jié)論：BTX-A注射后椎旁肌顯微結(jié)構(gòu)部分可逆，BTX-A注射不影響血清褪黑素水平，但能影響椎旁肌鈣調(diào)蛋白的分布。
　　 實(shí)驗(yàn)第三部分：一側(cè)椎旁肌注射BTX-A后雙足鼠脊柱側(cè)凸的變化規(guī)律及追加注射BTX-A后脊柱側(cè)凸的變化情況
　　 目的：使用A型肉毒毒素(BTX-A)注射造成雙足鼠椎旁肌力量失衡，觀察雙足鼠出現(xiàn)

11、脊柱側(cè)凸的規(guī)律及追加注射BTX-A雙足鼠側(cè)凸的變化情況。
　　 方法：將30只4周齡雌性SD大鼠隨機(jī)分A、B、C組，每組10只。首先，所有大鼠截除雙上肢建立雙足鼠模型，術(shù)后即刻予高籠喂養(yǎng)。3天后，A組、B組大鼠椎旁肌右側(cè)區(qū)域注射6.25U/100g劑量的BTX-A，C組為對照組，注射等量生理鹽水。B組大鼠于首次注射6周后追加注射6.25U/100g BTX-A一次，A、C組追加注射等量生理鹽水一次。各組大鼠于首次注射后2周、4周