包蟲病診斷標(biāo)志物高通量篩選與應(yīng)用研究.pdf

1、目的:1.建立多房棘球絳蟲分泌蛋白數(shù)據(jù)庫。2.構(gòu)建棘球絳蟲蛋白芯片及篩選診斷抗原。3.制備及評價棘球絳蟲重組抗原。
　　方法:1.建立多房棘球絳蟲分泌蛋白數(shù)據(jù)庫:①通過檢索公開數(shù)據(jù)庫，建立多房棘球絳蟲全基因組蛋白質(zhì)序列本地數(shù)據(jù)庫。②利用生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測多房棘球絳蟲分泌蛋白質(zhì)組。③利用Blast2GO和KAAS自動注釋軟件對分泌蛋白進(jìn)行注釋與分析。2.構(gòu)建棘球絳蟲蛋白芯片及篩選診斷抗原:①采用博奧Personal Arraye

2、rTM16芯片點(diǎn)樣儀將棘球絳蟲重組抗原蛋白作為備選抗原點(diǎn)至于環(huán)氧基玻片上制備蛋白芯片。②選用50份包蟲病病人血清和50份正常人血清篩選診斷抗原。⑨采用博奧LuxScan HT24掃描儀于λ=532nm波長處掃描讀取數(shù)據(jù)。④對數(shù)據(jù)進(jìn)行校準(zhǔn)后利用Mev軟件制作抗原抗體反應(yīng)熱圖譜。3.制備及評價棘球絳蟲重組抗原:①采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)對候選診斷抗原進(jìn)行表達(dá)和純化。②對重組抗原蛋白進(jìn)行ELISA評估。
　　結(jié)果:1.對目前公開的數(shù)據(jù)庫

3、進(jìn)行檢索并序列比對之后共采集到10780條有效多房棘球絳蟲全基因組蛋白質(zhì)序列。其中，共發(fā)現(xiàn)875條含有信號肽的蛋白序列，307條屬于膜結(jié)合蛋白;38條含糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl-phosphatidylinositol，GPI)錨定位點(diǎn);12條定位于線粒體。最終獲得了含518條序列的多房棘球絳蟲分泌蛋白組，占全基因組編碼蛋白序列的4.8％(518/10780)。經(jīng)Blast2GO和KAAS軟件注釋分析后結(jié)果顯示分泌蛋白主要出現(xiàn)在

4、人類疾病、新陳代謝過程、環(huán)境信息處理、有機(jī)系統(tǒng)、細(xì)胞過程和遺傳信息處理通路上，其中有6條序列與寄生蟲感染直接相關(guān)。2.成功制備含188個無細(xì)胞麥胚表達(dá)的棘球絳蟲重組蛋白與陽性陰性參照點(diǎn)的蛋白芯片，經(jīng)血清篩選后（閾值≥2.0作為陽性陰性反應(yīng)臨界值），共獲得6個敏感性較高的潛在診斷抗原，分別是EgP9、EgP11、EgP22、EgP43、EgP44和EgP164，其敏感性依次達(dá)到74％(37/50)、44％(22/50)、20％(10/50

5、)、40％(20/50)、50％(25/50)、24％(12/50)，特異性為98％(49/50)、100％(50/50)、100％(50/50)、100％(50/50)、100％(50/50)、100％(50/50)。3.采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)對已篩選到的6個診斷抗原進(jìn)行大量表達(dá)與純化，其結(jié)果顯示:EgP9、EgP11、EgP22、EgP43、EgP164表達(dá)成功，其中EgP9/22/43/164以可溶形式表達(dá)，EgP11為包涵體形

6、式表達(dá)。采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)方法對制備的重組抗原進(jìn)行初步評估，其結(jié)果顯示EgP9/11/22/43/44/164/HCF的敏感性分別達(dá)到83％(34/41)、56％(23/41)、88％(36/41)、49％(20/41)、68％(28/41)、83％(34/41)和100％(41/41)，特異性分別達(dá)到96％(45/47)、96％(45/47)、98％(46/47)、96％(46/47)、96％(46/47)、94％(4

7、4/47)和98％(46/47)。對重組抗原EgP9/22/164/P43蛋白進(jìn)行大規(guī)模血清學(xué)評價，其敏感性依次達(dá)到42％(65/156)，53％(82/156)，50％(78/156)和73％(115/157)，特異性為94％(89/95)，96％(92/96)，94％(90/96)和96％(92/96)。四個重組抗原的組合敏感性和特異性均達(dá)到了82％。重組抗原EgP9/43/164與其他蟲種之間的交叉反應(yīng)率明顯低于囊液粗抗原HCF。