SARS-CoV S1蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)和純化.pdf

1、目的：引起嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(severeacuterespiratorysnydrome，SARS)的病原體SARS冠狀病毒是一種新型的冠狀病毒。Spike(S)蛋白為Ⅰ型跨膜蛋白，是SARS冠狀病毒表面的最重要的膜蛋白，具有與受體結(jié)合的功能和促進(jìn)病毒與細(xì)胞膜融合的作用，它與病毒的致病性及組織親嗜性密切相關(guān)，可能是病毒誘發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)生成中和抗體的主要抗原蛋白。S蛋白可以分為兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：S1和S2。S1蛋白上存在與受體結(jié)合的位點(diǎn)，S2

2、與病毒外殼膜和宿主細(xì)胞膜的融合有關(guān).本研究的目的在于構(gòu)建能在真核細(xì)胞中高量表達(dá)的S1重組融合蛋白質(zhì)粒。并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，再加以純化獲得具有生物活性的重組融合蛋白。為SARS機(jī)理探討和疫苗研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：利用自行設(shè)計(jì)的引物，以包含全長(zhǎng)SARS-CoVS蛋白基因的質(zhì)粒(PUC18S)為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出SARS-CoVS1蛋白基因序列，與分泌序列CD5L和人IgGFc段一起連接到真核表達(dá)載體pEAK12中。構(gòu)

3、建能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)出帶有人IgGFc標(biāo)簽的S1融合蛋白的質(zhì)粒。將構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293E細(xì)胞，通過(guò)嘌呤霉素藥物篩選出整合到細(xì)胞基因組，得到能高量表達(dá)S1融合蛋白的細(xì)胞株。經(jīng)westernblotting鑒定蛋白，純化SARS-CoVS1融合蛋白，用流式細(xì)胞技術(shù)鑒定了其生物活性。 結(jié)果：構(gòu)建出的真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定后，插入片斷準(zhǔn)確無(wú)誤。并篩選出穩(wěn)定表達(dá)分泌型SARS-CoVS1融合蛋白的細(xì)胞株。經(jīng)純化出的SARS