iPS細(xì)胞定向分化為胰島素分泌細(xì)胞的相關(guān)研究.pdf

1、背景:誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(inducedPluripotentStemcells，iPScells)是一種將外源性因子轉(zhuǎn)入成體細(xì)胞使其發(fā)生重編程后得到的具有干細(xì)胞特性的多能性干細(xì)胞。iPS細(xì)胞具有類似胚胎干細(xì)胞的相關(guān)特性，具有自我更新能力和多能性，有研究表明人的胚胎干細(xì)胞可以分化為胰島β細(xì)胞并表達(dá)相關(guān)特異標(biāo)記，成功治愈糖尿病小鼠模型。
　　目的：探討在相關(guān)生長因子的作用下人誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞分化為胰島β細(xì)胞的可能性及研究該過程中干性因

2、子Oct4和胰島β細(xì)胞相關(guān)因子Pdx1、MafA與insulin的表達(dá)變化。
　　方法:1.采用相關(guān)生長因子分四個(gè)階段誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞定向分化，使用實(shí)時(shí)定量PCR檢測分化過程中相關(guān)基因的表達(dá)變化;2.通過WesternBlot檢測分化成功后細(xì)胞與誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的干性基因Oct4和胰島β細(xì)胞相關(guān)基因在蛋白層面表達(dá)的差異;3.通過細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測分化結(jié)束后成熟細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá);4.檢測分化結(jié)束后成熟細(xì)胞分泌C肽

3、分泌驗(yàn)證目的細(xì)胞的分化成功，并且使用流式細(xì)胞術(shù)檢測分化效率。
　　結(jié)果:1.干性因子Oct4的表達(dá)降低主要發(fā)生在前兩個(gè)階段，第三階段和第四階段表達(dá)無差異性;2.在分化過程中，胰島β細(xì)胞相關(guān)因子Pdx1在第一階段就可檢測到，后期表達(dá)增強(qiáng);MafA表達(dá)在第一階段末期可檢測到低表達(dá)，但表達(dá)增強(qiáng)開始于第三、四階段;insulin在分化的第二階段末期被檢測到，表達(dá)明顯增強(qiáng)在第三和第四階段。3.WesternBlot結(jié)果顯示，與未分化前的誘導(dǎo)

4、多能性干細(xì)胞相比較，分化成熟后的細(xì)胞低表達(dá)Oct4蛋白，開始高表達(dá)Pdx1、MafA和insulin蛋白。4.細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明分化結(jié)束后的細(xì)胞中有部分細(xì)胞成功表達(dá)胰島素分泌相關(guān)基因;5.分化結(jié)束C肽分泌實(shí)驗(yàn)顯示在不同葡萄糖濃度的刺激下，目的細(xì)胞檢測到C肽分泌，并且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=2.878，P＜0.05)，證明胰島素分泌細(xì)胞的生成，流式細(xì)胞術(shù)證明分化的效率是5.40％。
　　結(jié)論:體外使用相關(guān)因子誘導(dǎo)iPS細(xì)胞可使其定向分