線粒體VDAC在母系遺傳原發(fā)性高血壓分子遺傳機(jī)制及功能中的研究.pdf

1、原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EHT)是當(dāng)今社會(huì)最常見(jiàn)的心血管疾病，與冠心病、腦卒中、心力衰竭和腎功能障礙密切相關(guān)，是導(dǎo)致多種心血管疾病死亡的主要危險(xiǎn)因素之一，其患病率在我國(guó)有逐年增高的趨勢(shì)。線粒體病由于突變的線粒體逐漸積累，導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化功能受損，細(xì)胞功能下降。線粒體tRNA突變是線粒體疾病的研究熱點(diǎn)之一。線粒體含有22種tRNA。既往的研究也發(fā)現(xiàn)原發(fā)性高血壓具有家族聚集傾向性，其中一些具有明顯母系

2、遺傳特點(diǎn)，而且線粒體疾病往往同時(shí)表現(xiàn)血壓升高，提示我們線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)突變可能與血壓升高有一定的相關(guān)性。 我們對(duì)2000名原發(fā)性高血壓患者進(jìn)行了測(cè)序分析，其中發(fā)現(xiàn)一個(gè)具有典型母系遺傳特點(diǎn)的大家系，我們收集了5代104人，其中母系成員27人。我們對(duì)家系成員的一般情況、血壓等進(jìn)行測(cè)量和統(tǒng)計(jì)，對(duì)其中42人進(jìn)行全身體格檢查、采血進(jìn)行生化和心臟超聲檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該家系中母系成員高血壓患病率高達(dá)

3、55.6％，非母系成員高血壓患病率15.6％(P＜0.01)；母系成員高血壓發(fā)病年齡有提前的趨勢(shì)(Ⅱ代62.0±6.2歲；Ⅲ代46.3±5.8歲；Ⅳ代23.3±2.9歲)；母系成員血壓與年齡、吸煙、飲酒和高鹽飲食有明顯相關(guān)性(P＜0.05)；母系成員血糖、總膽固醇、血鈉明顯高于非母系成員(P＜0.05)。分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在線粒體tRNAn?；虻?263位點(diǎn)發(fā)生了A一÷G點(diǎn)突變，該位點(diǎn)在各個(gè)生物都是高度保守的，而且4263位于tRNA

4、Ile基因的受體臂5’端，在這個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變會(huì)影響tRNA與氨基酸的結(jié)合。 為了進(jìn)一步探討線粒體tRNAIle4263 A→G點(diǎn)突變影響血壓的具體機(jī)制，我們對(duì)該家系的4個(gè)母系成員(3個(gè)血壓異常和1個(gè)血壓正常者)和3名遺傳背景相同的對(duì)照者建立了傳代淋巴細(xì)胞系，對(duì)這些細(xì)胞的生長(zhǎng)速度及線粒體外膜的VDAC(voltage-dependent anion channel)在攜帶tRNAIle4263 A→G點(diǎn)突變高血壓患者發(fā)病中的作用進(jìn)

5、行了初步研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶A4263G突變者淋巴細(xì)胞倍增時(shí)間明顯延長(zhǎng)；VDAC及凋亡相關(guān)因子Bax在高血壓患者表達(dá)增高，而淋巴細(xì)胞sKCa通道表達(dá)沒(méi)有明顯差異；流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電勢(shì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照者比較攜帶tRNAIle4263 A→G點(diǎn)突變高血壓者線粒體膜電勢(shì)降低，而加入CsA-VDAC拮抗劑后線粒體膜電勢(shì)升高，與正常者之間的差異消失；共聚焦顯微鏡檢測(cè)線粒體外膜的VDAC與Bax蛋白結(jié)合的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)攜帶tRNAIle42

6、63 A→G點(diǎn)突變高血壓患者線粒體外膜VDAC綠色熒光與Bax蛋白紅色熒光融合，而正常對(duì)照者兩者沒(méi)有融合，在加入CsA后高血壓患者線粒體外膜VDAC綠色熒光與Bax蛋白紅色熒光沒(méi)有融合。 為明確VDAC在攜帶mtDNA突變的高血壓患者細(xì)胞線粒體鈣循環(huán)中的作用，我們?cè)趯?duì)具有母系遺傳特點(diǎn)的原發(fā)性高血壓流行病學(xué)調(diào)查研究的基礎(chǔ)上，對(duì)前期發(fā)現(xiàn)的攜帶mtDNA4263A→G突變的原發(fā)性高血壓大家系患者采集血液樣本，通過(guò)建立傳代的淋巴細(xì)胞系，

7、分別加入VDAC抑制劑-CsA和PT(通透性轉(zhuǎn)變孔道)開(kāi)放劑-蒼術(shù)苷，利用共聚焦顯微鏡技術(shù)研究VDAC在攜帶mtDNA突變的高血壓患者細(xì)胞線粒體鈣循環(huán)中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照者淋巴細(xì)胞線粒體內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度及△ψm(線粒體膜電勢(shì))降低，在加入蒼術(shù)苷后正常者線粒體內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度增加，而突變攜帶者沒(méi)有明顯改變，但兩者△ψm均降低，而加入CsA后可以抑制蒼術(shù)苷作用。 通過(guò)此課題研究治療直接證明了線粒體tRNAIle4263 A→G點(diǎn)突變

8、與高血壓發(fā)病直接有關(guān)，我們的實(shí)驗(yàn)也首次從生物進(jìn)化及分子生物學(xué)證據(jù)證明：線粒體DNAtRNAIle4263 A→G點(diǎn)突變?cè)诰哂心赶颠z傳特點(diǎn)的高血壓發(fā)病中起著重要作用；通過(guò)對(duì)攜帶線粒體tRNAIle4263 A→G點(diǎn)突變高血壓患者和正常者淋巴細(xì)胞建立細(xì)胞系，研究發(fā)現(xiàn)線粒體外膜的VDAC表達(dá)及功能改變可以影響線粒體膜電勢(shì)(△ψm)、誘導(dǎo)凋亡物質(zhì)釋放及對(duì)線粒體內(nèi)鈣([Ca2+]m)，因此推測(cè)VDAC在線粒體tRNAIle4263 A→G點(diǎn)突變導(dǎo)