PI3K-Akt信號通路對人肝癌細(xì)胞中胱硫醚-γ-裂解酶基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制及其生物學(xué)功能的研究.pdf

1、目前認(rèn)為內(nèi)源性硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)后發(fā)現(xiàn)的第三種氣體信號分子，在哺乳動物中廣泛存在，并在許多生理病理過程中發(fā)揮了重要作用，例如在心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及炎癥免疫調(diào)節(jié)等方面，內(nèi)源性H2S都有著不同的生理功能。哺乳動物體內(nèi)的H2S主要通過含硫的半胱氨酸代謝生成。胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CSE)是體內(nèi)轉(zhuǎn)硫途徑的關(guān)鍵酶。CSE作為一種

2、5’-磷酸吡哆醛依賴性酶，對H2S的產(chǎn)生以及含硫化合物的代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用。人CSE基因定位于染色體1p31.1，其編碼的CSE蛋白產(chǎn)物為43kDa，主要在心血管、肝臟、平滑肌等許多組織中普遍表達(dá)，并嚴(yán)格調(diào)控著體內(nèi)的H2S水平。已發(fā)現(xiàn)H2S引起的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)主要通過CSE/H2S體系產(chǎn)生，包括對DNA損傷，細(xì)胞周期，細(xì)胞增殖和凋亡過程都具有調(diào)節(jié)作用。目前對H2S生物學(xué)效應(yīng)的研究，主要集中在心血管系統(tǒng)和炎癥調(diào)節(jié)等方面，而H2S在腫瘤

3、細(xì)胞中的作用報道相對較少。有文獻(xiàn)報道，轉(zhuǎn)硫途徑中代謝酶的缺乏與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性，并且也有H2S直接影響腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡等過程的報道。PI3K/Akt作為體內(nèi)重要的信號通路，能夠調(diào)控眾多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與細(xì)胞的生長與存活、細(xì)胞間信息傳遞等，異常的Akt信號通路參與腫瘤的形成與轉(zhuǎn)移，具有促增殖抗凋亡等作用。因此我們關(guān)注在腫瘤發(fā)生發(fā)展中，PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與CSE基因表達(dá)調(diào)控之間可能的聯(lián)系。
　　 論文第一部分，我

4、們在8種人肝癌及永生化肝細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)CSE的蛋白質(zhì)水平與PI3K/Akt信號通路具有很好的相關(guān)性，且在CSE與Akt2 mRNA水平相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的穩(wěn)定過表達(dá)持續(xù)性激活A(yù)kt的小鼠MEF中，CSE蛋白質(zhì)和mRNA水平較陰性對照明顯升高，這些結(jié)果提示我們PI3K/Akt可能對CSE基因表達(dá)的調(diào)控具有重要作用。隨后，發(fā)現(xiàn)PI3K的特異性抑制劑LY294002能夠顯著下調(diào)人肝癌細(xì)胞CSE的蛋白和mRNA水平，且存在劑量和時間依賴性。我們

5、采用對Akt的過表達(dá)及基因敲低(knockdown)技術(shù)發(fā)現(xiàn)PI3K的下游分子Akt也可調(diào)控人肝癌細(xì)胞CSE蛋白質(zhì)和mRNA水平。而對抑癌基因PTEN進(jìn)行干擾或用IGF-1、胰島素刺激細(xì)胞能激活A(yù)kt從而促進(jìn)CSE基因表達(dá)。進(jìn)一步采用蛋白質(zhì)合成抑制劑CHX處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LY294002不影響CSE蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。以上結(jié)果說明PI3K/Akt信號通路可能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控人肝癌細(xì)胞CSE的基因表達(dá)水平。
　　 論文第二部分，我們研究PI

6、3K/Akt信號通路調(diào)控CSE基因表達(dá)的分子機(jī)制。首先構(gòu)建了六種不同長度的人CSE基因啟動子熒光素酶報告基因質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)-592/+139bp片段的CSE基因啟動子活性最強(qiáng)，為核心啟動子片段。LY294002處理細(xì)胞能夠抑制CSE基因的轉(zhuǎn)錄，驗(yàn)證了PI3K/Akt能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控CSE基因的表達(dá)。我們采用轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測軟件對核心啟動子中的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了預(yù)測，共發(fā)現(xiàn)包括4處Sp1結(jié)合位點(diǎn)在內(nèi)的8種常見轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，我們對所有

7、可能的結(jié)合位點(diǎn)一一分別進(jìn)行點(diǎn)突變，結(jié)果證明CSE基因啟動子中Sp1結(jié)合位點(diǎn)突變后能夠明顯下降CSE基因啟動子活性以及CSE的mRNA和蛋白質(zhì)水平。其中以最靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的兩處Sp1結(jié)合位點(diǎn)突變引起的CSE下調(diào)最為明顯。而其他幾種常見的轉(zhuǎn)錄因子如AP1，Oct-1，F(xiàn)oxD3，HNF-3β，v-Myb，c-Ets和E2F對CSE轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控作用不明顯。采用直接干擾Sp1水平，并結(jié)合ChIP的方法進(jìn)一步證明了Sp1能與CSE基因啟動子區(qū)

8、直接結(jié)合。而通過研究LY294002對CSE mRNA半衰期的影響發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路并未對CSE基因轉(zhuǎn)錄后水平有調(diào)控作用。以上結(jié)果說明Sp1作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子在PI3K/Akt信號通路對CSE基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。
　　 論文第三部分，我們主要研究了CSE的一些細(xì)胞生物學(xué)功能。實(shí)驗(yàn)證明CSE表達(dá)能夠影響內(nèi)源性H2S濃度的高低，并且CSE能夠促進(jìn)肝癌腫瘤細(xì)胞增殖，而這種促增殖作用是通過對細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)

9、實(shí)現(xiàn)的，對細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白p21Waf1/Cip1的影響可能是關(guān)鍵因素。而在腫瘤細(xì)胞的其他生物學(xué)行為中，CSE表達(dá)對人肝癌細(xì)胞凋亡能力以及對人肝癌細(xì)胞遷移能力都沒有明顯影響，而我們采用EMT相關(guān)蛋白檢測發(fā)現(xiàn)CSE在肝癌EMT的過程中也沒有明顯作用。
　　 綜上所述，本文研究發(fā)現(xiàn)在人肝癌細(xì)胞中，PI3K/Akt信號通路通過轉(zhuǎn)錄因子Sp1，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控CSE基因的表達(dá)，并且CSE及其催化產(chǎn)物內(nèi)源性H2S通過對細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)促進(jìn)肝