肺癌EGFR的基因突變檢測方法研究.pdf

1、目的：探討利用β-GAL相關(guān)LacZ基因插入片段閱讀框是否含有終止密碼子結(jié)合藍(lán)白篩選檢測EGFR基因缺失突變的可行性，利用高保真聚合酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開關(guān)檢測EGFR基因熱點突變，從而指導(dǎo)肺癌患者酪氨酸激酶抑制劑的合理用藥。
　　方法：在Genebank中查找EGFR基因19號外顯子野生型基因序列，查找pMD19-T質(zhì)粒LacZ基因序列，根據(jù)文獻(xiàn)已經(jīng)報道過的常見的致病突變△E746–A750和△L747–P753（insS），

2、設(shè)計普通 PCR引物和硫化修飾檢測引物，利用重疊延伸 PCR方法構(gòu)建野生型質(zhì)粒模板EA和△E746–A750突變質(zhì)粒模板D15、△L747–P753突變質(zhì)粒模板 D18，藍(lán)白篩選轉(zhuǎn)化野生質(zhì)粒和缺失突變質(zhì)粒，隨后對10份臨床肺癌病人血中游離DNA樣本進(jìn)行藍(lán)白篩選，檢測是否含有EGFR基因△E746–A750或△L747–P753突變,并測序鑒定藍(lán)白篩選方法的可靠性。隨后我們對10份臨床組織DNA樣本進(jìn)行鑒定，最后用本課題組開發(fā)的高保真聚合

3、酶介導(dǎo)的突變敏感性分子開關(guān)分別結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳與熒光定量PCR技術(shù)分別對10份臨床組織DNA樣本進(jìn)行EGFR基因△E746–A750或△L747–P753突變的定性與定量檢測。
　　結(jié)果：在 LB顯色固體培養(yǎng)基上，野生質(zhì)粒 EA的菌落均為白色，而 D15，D18突變質(zhì)粒的菌落均為藍(lán)色。10份臨床血中游離DNA樣本構(gòu)建的重組質(zhì)粒菌落顏色均為大量白色，少量藍(lán)色，挑選藍(lán)色菌落進(jìn)行測序，可以檢測出含有15bp缺失，未檢出18bp缺失，對

4、檢出15bp缺失突變對應(yīng)的肺癌組織DNA樣本進(jìn)行測序驗證，顯示組織樣本EGFR基因存在15bp缺失突變，與藍(lán)白篩選結(jié)果吻合。高保真聚合酶介導(dǎo)的分子開關(guān)結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳檢測10份臨床肺癌組織樣本顯示，樣本2、4、6號未檢測到EGFR基因15bp缺失，其余均檢測出EGFR基因15bp缺失，且所有樣本均未為檢測出EGFR基因18bp缺失。分子開關(guān)結(jié)合熒光定量PCR結(jié)果顯示除6號樣本外所有樣本均出現(xiàn)EGFR基因15bp缺失，拷貝數(shù)在103-1