Bufalin通過抑制mTOR-P70S6K通路的活化誘導ECA109細胞凋亡.pdf

1、食管癌是由食管鱗狀上皮或腺上皮的異常增生所形成的惡性病變。我國是食管癌的高發(fā)國家，其最常見的組織學類型是鱗狀細胞癌。目前對食管癌采取多種治療方法，主要是手術輔助放化療，但由于其早期癥狀不明顯，不易察覺，病人就診時部分已是中晚期，故預后不佳。大量分子生物學研究資料表明，食管癌的發(fā)生發(fā)展是多階段、多基因參與的過程，并且存在信號通路異常活化及相關蛋白的表達增強。因此，進一步研究抗腫瘤藥物對食管癌的影響及有關信號轉導途徑的活化，依然是食管癌治療

2、研究的目標。
　　多個研究報道證明，Akt/mTOR/P70S6K(70kDa ribosomal protein S6kinase)信號傳導通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中存在異常的激活。Akt/mTOR被認為是蛋白質合成的主要信號調節(jié)通路，參與細胞增殖、分化、遷移等調節(jié)。mTOR是一種多功能激酶，參與許多重要細胞功能的調節(jié)，其活化磷酸化P70S6K可促進mRNA翻譯，生成細胞周期跨越G1期所必需的各種蛋白，抑制mTOR可致P70S6K磷酸

3、化受阻，進而抑制翻譯進程，使細胞周期停滯并誘導凋亡。
　　Bufalin是一種毒性配基，提取于中藥蟾酥，來源于黑眶蟾蜍和中華大蟾蜍耳后、皮膚腺分泌之漿液，屬蟾毒甾烯類化合物。國內(nèi)外研究顯示，它可以誘導多種白血病細胞和一些實體瘤細胞凋亡，并下調Bcl-2、c-myc、WT-1等腫瘤相關基因的表達。但其誘導凋亡的確切機制仍不清楚。
　　目前關于蟾蜍靈誘導食管癌細胞凋亡機制的研究很少，本實驗以食管癌ECA109細胞為模型，觀察Bu

4、falin抑制mTOR/P70S6K通路的活化，從而誘導ECA109細胞凋亡，以探討其可能的機制。
　　目的:探討B(tài)ufalin通過抑制mTOR/P70S6K通路的活化誘導ECA109細胞凋亡過程中的作用。
　　方法:
　　1將攜帶高活性mTOR基因質粒wtmTOR轉化至DH5α大腸桿菌中進行擴增，并使用脂質體法將wtmTOR成功轉染到食管癌ECA109細胞中，Western Blot方法分別檢測轉染質粒0h、12h、

5、24h、30h、36h、42h、48h后細胞內(nèi)P70S6K的蛋白表達及其磷酸化水平(p-P70S6K)的變化，并得出轉染的最佳時間。
　　2用Western Blot方法分別檢測60 nmol/l Bufalin作用于ECA109細胞2h、6h、12h、24h、36h、48h后細胞內(nèi)cIAP-1、BAD的蛋白表達。
　　3用Western Blot方法分別檢測不同處理組（對照組、空載體轉染組、wtmTOR轉染組、轉染后加Bu

6、falin組）細胞內(nèi)P70S6K、p-P70S6K、cIAP-1及BAD的蛋白的變化，進而研究轉染wtmTOR質粒及Bufalin對mTOR通路和細胞凋亡的影響。
　　4采用流式細胞儀通過PI染色進行細胞周期解析及凋亡判定。
　　5用TUNEL標記法檢測細胞的凋亡指數(shù)。
　　6采用倒置顯微鏡及Gimsa染色觀察細胞形態(tài)學變化。
　　結果:
　　1成功將wtmTOR質粒擴增并轉染到食管癌細胞中，檢測其下游基因

7、的蛋白表達。
　　(1) P70S6K在轉染不同時間后蛋白水平無明顯變化（0.599±0.011，0.594±0.013,0.606±0.012,0.608±0.010,0.592±0.017,0.599±0.021,0.600±0.036，P＞0.05），差異無統(tǒng)計學意義。
　　(2) p-P70S6K隨轉染后時間的增加(0h、12h、24h)表達量逐漸升高，至24h達到最高值，此后(30h、36h、42h、48h)開始下

8、降（0.389±0.013，0.411±0.019,0.609±0.016,0.573±0.015,0.394±0.013,0.383±0.006,0.262±0.018，P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學意義。
　　2 Western Blot檢測60 nmol/l Bufalin作用于ECA109細胞2h、6h、12h、24h、36h、48h后細胞內(nèi)cIAP-1和BAD的蛋白表達變化。
　　(1) cIAP-1的蛋白水平逐漸

9、降低(0.542±0.003，0.517±0.007，0.455±0.002，0.414±0.004，0.369±0.026，0.218±0.015，P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　(2) BAD的蛋白水平逐漸升高（0.456±0.009，0.659±0.042，0.750±0.023，0.813±0.019，0.937±0.013，1.047±0.013，P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學意義。
　　3 Wester

10、n Blot結果顯示不同處理組間細胞內(nèi)P70S6K、p-P70S6K、cIAP-1和BAD的蛋白表達變化。
　　(1) P70S6K的蛋白水平在不同處理組間無明顯差別（0.901±0.045，0.914±0.023，0.900±0.020，0.898±0.022，P＞0.05），差異無統(tǒng)計學意義。
　　(2) p-P70S6K的蛋白水平在wtmTOR轉染組的表達明顯高于對照組和空載體轉染組，當轉染后加入Bufalin2h，p

11、-P70S6K蛋白水平又受到抑制，明顯下降(0.761±0.085，0.766±0.068，0.952±0.059，0.762±0.019，P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　(3) cIAP-1的蛋白水平在wtmTOR轉染組的表達明顯高于對照組和空載體轉染組，轉染后加入Bufalin24h，cIAP-1蛋白水平又受到抑制，明顯下降(0.721±0.019，0.731±0.248，0.840±0.010，0.742±0.02

12、1，P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　(4) BAD的蛋白水平在wtmTOR轉染組的表達低于對照組和空載體轉染組，當轉染后加入Bufalin24h，BAD蛋白水平又明顯升高（0.929±0.046，0.944±0.060，0.779±0.182，1.029±0.049，P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學意義。
　　4流式細胞儀結果顯示:
　　(1)0、20、40、60、80、100 nmol/l Bufalin處理

13、ECA109細胞24h，細胞凋亡率逐漸升高(3.01±0.317％，3.67±0.306％，6.74±0.198％，7.59±0.340％，18.22±0.651％，28.60±1.737％，P＜0.05);并出現(xiàn)明顯的G2/M期阻滯，G2/M期細胞百分比由對照組的9.24±1.919％增加至70.5±2.934％，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　(2)流式細胞儀檢測不同處理組細胞凋亡率，wtmTOR轉染組的凋亡率明顯低于對照組和空載體

14、轉染組，轉染后加入Bufalin24h，細胞凋亡率又明顯升高（5.60±0.411％，5.46±0.341％，4.19±0.210％，10.12±0.325％，P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學意義。
　　5 TUNEL標記法顯示:細胞核棕黃色著染者為凋亡細胞，而正常細胞的胞核不著染。0、20、40、60、80、100 nmol/l Bufalin處理ECA109細胞24h，凋亡指數(shù)隨用藥濃度增加逐漸升高（2.13±0.431％，5.

15、56±1.345％，7.87±1.443％，15.17±2.657％，36.69±2.986％，50.98±2.978％，P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學意義。
　　6 Bufalin作用于ECA109細胞后細胞的形態(tài)學改變
　　(1)倒置顯微鏡觀察:隨著藥物作用時間的延長，可見細胞皺縮，由多角形變?yōu)閳A形，細胞表面逐漸凸起小膜泡，細胞不斷地脫落懸浮于培養(yǎng)液中?；罴毎麛?shù)量明顯減少，死亡細胞增多。
　　(2) Gimsa染色

16、觀察:Bufalin作用于ECA109細胞24h后，出現(xiàn)典型的凋亡改變，表現(xiàn)為細胞膜完整，胞漿中出現(xiàn)空泡、核染色質濃縮、碎裂成塊彌散在細胞漿中，并可見膜結構包裹的凋亡小體。同時可見少量壞死細胞，細胞輪廓不清，細胞核溶解消失。
　　結論:
　　1 Bufalin以時間依賴性方式促進BAD的表達，抑制cIAP-1蛋白表達，從而促進食管癌ECA109細胞凋亡。
　　2 Bufalin通過抑制mTOR/P70S6K通路的活化誘