凋亡相關(guān)新基因apr-2的克隆、表達(dá)及多克隆抗血清的制備.pdf

1、我們通過克隆apr-2編碼區(qū)基因,獲得APR-2原核表達(dá)蛋白和抗血清,為進(jìn)一步對該基因的研究奠定基礎(chǔ).該研究進(jìn)行了如下四方面實(shí)驗(yàn):1.利用全反式維甲酸(ATRA)建立HL-60細(xì)胞凋亡模型,提取HL-60凋亡細(xì)胞總RNA,根據(jù)GeneBank中apr-2 cDNA編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)引物,采用RT-PCR方法獲取apr-2 cDNA編碼區(qū)序列,回收純化后與PGEM-T Easy載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,構(gòu)建重組克隆載體PGEM-T Easy/a

2、pr-2,進(jìn)行序列分析.2.測序正確后,將目的片段亞克隆入PGEX-4T-2原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)重組融合蛋白小樣表達(dá),確定目的基因的表達(dá)情況后,進(jìn)一步大量表達(dá),利用凝膠自動(dòng)掃描分析目的蛋白在細(xì)菌中的表達(dá)分布.運(yùn)用電洗脫方法對獲得的融合蛋白進(jìn)行初步純化.3.用獲得的融合蛋白免疫新西蘭大白兔,制備兔多克隆抗血清,飽和硫酸胺法純化,酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)檢測抗血清滴度,運(yùn)用Western