防治煙草赤星病根際芽孢桿菌的篩選及其抗菌物質研究.pdf

1、從健康煙草根際分離到669株根際芽孢桿菌，通過平板對峙培養(yǎng)、代謝產(chǎn)物活性檢測，獲得9株抑制煙草赤星病菌(Alternaria alternata)活性較強的菌株，其菌體及代謝粗提物產(chǎn)生的抑菌圈均在10 mm以上；離體防效和田間小區(qū)防治試驗表明，B6、B75菌株的含菌發(fā)酵液和代謝粗提物的離體防效分別為75.6％、76.9％和62.5％、64.7％，小區(qū)防效分別為70.3％、75.8％和60.3％、64.4％。代謝粗提物的抑菌作用試驗發(fā)現(xiàn)，

2、 B75菌株的代謝粗提物在一定濃度范圍能抑制赤星病菌孢子萌發(fā)、菌絲生長與產(chǎn)孢。 采用生理生化、Biolog和16S rDNA序列測定，對篩選的一株煙草赤星病菌拮抗細菌B75菌株進行了鑒定，生理生化鑒定顯示該菌株與Bacillus subtilis極為相似；Biolog鑒定顯示其為B.subtilis；進一步對該菌株作16s rDNA序列測定與分析，表明其與已報道的B.subtilis具有99.8％的同源性，二者在所構建的系統(tǒng)發(fā)育

3、樹上處于同一個分支。因此確定B75菌株屬于枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。 以NB培養(yǎng)液對B75菌株進行培養(yǎng)試驗，結果表明，B75在對數(shù)生長的中期開始產(chǎn)生抗菌物質，在生長的衰退期前存在一個產(chǎn)生抗菌物質的高峰期；在25～50℃、oH4.0～8.5范圍內(nèi)均可產(chǎn)生抗菌物質，其中30℃和pH6.0的培養(yǎng)條件下最適。不同的裝液量試驗結果表明，B75菌株在裝液量為100ml/500ml三角瓶時是菌體生長及產(chǎn)生抗菌物質的最適宜量。不同的

4、碳/氮源試驗結果表明，甘露醇、酵母膏最有利于B75菌株菌體生長，且產(chǎn)生的抗菌物質抑菌活性較強。 枯草芽孢桿菌B75菌株發(fā)酵粗提液的抗菌物質可被飽和度為40％的硫酸銨完全沉淀。對該沉淀的部分理化性質研究發(fā)現(xiàn)，121℃處理30min，活性保持不變；在pH 4-8的范圍內(nèi)，隨pH的增大，溶解度增大，但pH 8室溫下存放24h，活性明顯下降；用胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K處理，活性無明顯降低。該沉淀用磷酸緩沖液溶解后，經(jīng)Sephadex

5、 G25脫鹽、Source 15 FLPC(fast protein liquidchromatography)、反相C18 HPLC(high performance liquid chromatography)多次分離、純化，得到1個活性峰。取活性峰在Q-TOF2(electrospray ionization quadrupoletime-of-flight mass spectrometry)檢測時發(fā)現(xiàn)有2個峰，分子量為分別為1

6、463.81D、1477.82D。經(jīng)Q-TOF 2和ApexQ FT-MS(Fourier-transform ion cyclotron resonancemass spectrometry)分析，鑒定為芬枯草桿菌素(Fengycin)。采用濃鹽酸、硫酸銨沉淀枯草芽孢桿菌B75的無菌發(fā)酵液中的抗菌物質，磷酸緩沖液(50 mmol/L，pH 6.8)、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯8種溶劑提取菌體抗菌物質，并進行生

7、物活性檢測和HPLC分析。結果表明硫酸銨沉淀物的活性比濃鹽酸強；甲醇、乙醇、乙腈、丙酮提取物具有抑菌活性，其抗菌活性顯著低于濃鹽酸、硫酸銨沉淀物；同一RP-HPLC條件下，硫酸銨沉淀的雜質比濃鹽酸多，濃鹽酸與硫酸銨沉淀物的活性峰無差異，甲醇、乙醇、乙腈、丙酮提取物的活性峰可完全重疊，比較發(fā)現(xiàn)濃鹽酸與硫酸銨沉淀物的活性峰明顯不同于菌體提取物。這些結果說明，枯草芽孢桿菌B75液體發(fā)酵的無菌濾液、菌體中均存在抗菌物質，且存在兩者之中的抗菌物質