Slit-Robo信號在口腔癌和粘液表皮樣癌中的作用機理研究.pdf

1、Slit蛋白是對軸突生長和神經(jīng)元遷移起導向作用的軸突定向分子家族成員之一，它通過其受體家族Roundabout(Robo)作為神經(jīng)軸突導向和神經(jīng)元遷移的排斥性因子以及白細胞趨化的抑制因子發(fā)揮重要的作用。已有研究證實在多種實體瘤中均有Slit-2蛋白的表達，Robol表達于血管內皮細胞，并且Slit-Robo信號可以介導腫瘤細胞與內皮細胞間“對話”機制，從而參與了腫瘤新生血管的形成，這為抑制腫瘤的生長提供了新的分子靶點。而在腫瘤發(fā)生發(fā)展中

2、腫瘤細胞相互之間的“信息通訊”也是十分重要的，新近的研究發(fā)現(xiàn)Slit-Robo信號在腫瘤細胞之間有著一定的調控功能，特別是在腫瘤細胞增殖和凋亡過程中有著重要的作用。本課題是在Slit-Robo信號介導腫瘤細胞與內皮細胞間“對話”機制及其調控腫瘤細胞增殖、凋亡機制的研究基礎上繼續(xù)探討Slit-Robo信號對口腔癌的發(fā)生發(fā)展是否同樣有著重要作用，并以該信號是否通過調控口腔癌成癌過程中血管生成而參與口腔癌癌變?yōu)檠芯恐攸c，探討Slit-Robo

3、信號在口腔癌形成中的作用機制；同時通過另一口腔常見的涎腺惡性腫瘤細胞，并以該信號是否通過調控該腫瘤細胞的增殖、凋亡從而參與腫瘤的形成過程為研究重點，探討Slit-Robo信號是否廣泛參與了腫瘤細胞之間的“對話”，再次去證實腫瘤形成中這一新的分子機制。 為了探討以上問題，我們選用了口腔癌成癌過程中各階段人組織標本作為研究對象，口腔癌是頭頸部較常見的惡性腫瘤，正常口腔粘膜需經(jīng)過粘膜單純增生、粘膜異常增生及原位癌階段最終發(fā)展成為口腔鱗

4、癌。本研究采用免疫組織化學方法檢測了口腔粘膜癌變過程中Slit2蛋白及Robol蛋白的表達，并同時檢測VEGF的表達和腫瘤微血管密度(MVD)，重點觀察Slit2蛋白在口腔癌成癌各階段中的表達及其與血管生成的關系。同時我們選用了人涎腺粘液表皮樣癌高轉移Mc3細胞系為研究對象，人涎腺粘液表皮樣癌是口腔最為常見的惡性腫瘤之一，人涎腺粘液表皮樣癌高轉移Mc3細胞系為MEC-1肺轉移亞系，它保持了粘液表皮樣癌的組織學特征，具有生長較快，S期細胞

5、比例增高，接觸抑制力下降，轉移能力強等特點。本研究采用Slit-Robo信號特異性阻斷性抗體R5為干預手段，觀察Mc3細胞在R5抗體作用下增殖、凋亡能力的改變。 本研究的主要內容和結果：一、臨床標本Slit2、Robo1蛋白、VEGF及vWF的表達研究1、通過免疫組織化學方法檢測Slit2蛋白表達，證實在正?？谇徽衬ぁ⑸掀渭冊錾衬?、上皮異常增生粘膜、原位癌組織、鱗癌組織的Slit2蛋白均有表達并且依次增高，并且從上皮異常增生

6、粘膜開始Slit2蛋白表達與正常粘膜相比有明顯增加，當癌細胞突破基底膜進入固有層形成浸潤性癌時，Slit2蛋白表達無論在陽性細胞數(shù)量或強度方面均達到了高峰，說明Slit信號在上皮異常增生時開始啟動，并隨腫瘤的發(fā)生發(fā)展逐步增加，在原位癌時有了較明顯表達，在浸潤癌時出現(xiàn)了較強的瀑布式的表達，提示Slit信號與口腔癌的發(fā)生發(fā)展有密切關系。 2、Robo1蛋白在口腔粘膜癌變過程中的表達口腔粘膜癌變過程中Robo1蛋白的表達比較弱且分布無

7、明顯特征，各組間表達亦無明顯規(guī)律，口腔鱗癌組陽性表達例數(shù)較多，可見多數(shù)癌細胞Robo1蛋白弱表達，腫瘤血管內皮細胞陽性表達，部分炎細胞也呈陽性染色。口腔鱗癌組與正常粘膜組、上皮單純增生組、上皮異常增生組及原位癌組間差異無顯著性。 3、通過免疫組織化學方法檢測VEGF蛋白表達，證實在口腔粘膜癌變過程中VEGF的表達逐漸增強，與Slit2蛋白陽性表達趨勢上是一致的，呈顯著性正相關，隨著口腔粘膜癌變過程的發(fā)展表達均逐漸增強，自異常增生

8、組開始與正常粘膜組間即有了顯著性差異，鱗癌組兩者均達到高峰。說明Slit2蛋白可能打開了血管生成表型的開關，通過新生血管的形成加速癌前病變向癌的轉化進程，這在口腔癌血管生成機制中可能具有重要意義。 4、通過免疫組織化學方法檢測vonWillebrand'sfactor(vWF)表達，通過vWF對血管內皮細胞特異性染色，計數(shù)腫瘤微血管密度(MVD)。本實驗證實MVD是隨著腫瘤惡性程度的升高而增加，并在原位癌發(fā)生了質的改變，鱗癌達到

9、高峰。MVD與Slit2蛋白表達及VEGF表達均呈顯著性正相關，這是血管形成適應腫瘤快速生長的結果，同時也說明了Slit2蛋白與腫瘤新生血管形成有著密切的關系。 二、Slit-Robo信號在人涎腺粘液表皮樣癌高轉移Mc3細胞系增殖、凋亡中的功能研究1、通過免疫組織化學證實Mc3細胞同樣表達Slit2、Robo1蛋白，再次證實在常見的人涎腺惡性腫瘤中Slit-Robo信號同樣可能參與了腫瘤細胞之間的“對話”。 2、通過R5

10、抗體作用于Mc3細胞，采用MTT比色法、軟瓊脂克隆形成實驗以及流式細胞儀細胞內抗原檢測法檢測PCNA蛋白的表達，證明Slit-Robo信號可通過調控腫瘤細胞的增殖來影響腫瘤的發(fā)生。 3、通過R5抗體作用于Mc3細胞，采用FITC-AnnexinV/PI檢測法檢測R5抗體組的凋亡細胞發(fā)生率達到33.6％；流式細胞儀檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)，Mc3細胞復制停滯于S期；并且DNA電泳顯示清晰的DNALadder；Hoechst/PI雙染法觀察

11、各組正常細胞、凋亡細胞及壞死細胞的差異；以流式細胞儀細胞內抗原檢測法檢測R5抗體作用下細胞caspase-3蛋白的含量，同對照組相比明顯增強。以上結果均證實了R5抗體作用后的Mc3細胞增殖與凋亡之間保持著一定的動態(tài)平衡狀態(tài)，Slit-Robo信號可能以抑制細胞凋亡的形式參與了腫瘤的形成過程，而caspase-3蛋白可能是一條重要的信號轉導途徑。 本研究的結果表明：口腔鱗癌癌變過程中Slit2蛋白陽性表達與其惡性程度呈正相關，并且