換錦花F3’H和MYB4同源基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、石蒜屬植物在我國(guó)資源豐富,天然分布最多且最廣。石蒜屬植物因其豐富的花色、花型,被譽(yù)為“中國(guó)的郁金香”,其觀賞價(jià)值在園林和園藝上有重要的意義。換錦花的花色具有特殊性,即紫紅色的花瓣以及花瓣尖端帶有藍(lán)色,為研究換錦花特殊的顏色形成機(jī)理,本研究以換錦花的花瓣為材料,通過(guò)RT-PCR和 RACE技術(shù)相結(jié)合的方法獲得換錦花花色形成相關(guān)的LsF3’H基因和LsMYB4基因,同時(shí)利用分子生物和生物信息學(xué)的方法分析其核苷酸序列以及編碼的氨基酸序列,并利

2、用熒光定量 PCR技術(shù)對(duì)換錦花在花發(fā)育不同時(shí)期、不同組織器官以及花色存在差異不同無(wú)性系中的表達(dá)模式,來(lái)分析這些基因在換錦花花色形成中的功能和作用;通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體,利用異源轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)一步驗(yàn)證和分析研究LsF3’H基因和LsMYB4基因?qū)Q錦花花色素苷生物合成的作用。主要的研究結(jié)果如下:
　　(1)通過(guò) NCBI搜索同源基因,并設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物克隆到換錦花 LsF3’H基因和LsMYB基因片段;并結(jié)合 RACE技術(shù)獲得長(zhǎng)1587 b

3、p的 LsF3’H基因和793bp的LsMYB4基因cDNA全長(zhǎng)序列;對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析結(jié)果表明LsF3’H具細(xì)胞色素P450的特異結(jié)構(gòu)域,LsMYB4具有R2R3-MYB高度保守的特異結(jié)構(gòu),并對(duì)其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),在多序列比對(duì)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),對(duì)其進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析,其分類(lèi)和植物分類(lèi)學(xué)基本一致,得出LsF3’H屬于CYP75亞家族,LsMYB4和擬南芥亞群AtMYB4相似度最高。
　　(2)利用熒光定量PCR分析換

4、錦花中的LsF3’H和LsMYB4基因的表達(dá),結(jié)果表明,LsF3’H和LsMYB4基因的表達(dá)均具有組織特異性,LsF3’H基因在不同組織和不同花發(fā)育時(shí)期均有表達(dá),而且在花瓣中的相對(duì)表達(dá)量比葉多10倍,在盛花期的相對(duì)表達(dá)量比花苞期高70倍。在換錦花不同花色的無(wú)性系中表達(dá)存在差異,花色較淺的換錦花無(wú)性系相對(duì)表達(dá)量高于其它無(wú)性系;LsMYB4花瓣中的相對(duì)表達(dá)量比葉多9-10倍,在盛花期的相對(duì)表達(dá)量比花苞期多20倍。不同花色的無(wú)性系中表達(dá)存在差

5、異,花色較淺的換錦花無(wú)性系相對(duì)表達(dá)量高于其它無(wú)性系,可以推測(cè)LsMYB4基因在調(diào)控?fù)Q錦花花色形成的過(guò)程中起著負(fù)調(diào)控的作用。
　　(3)通過(guò)雙酶切的方法構(gòu)建LsF3’H和LsMYB4基因的過(guò)表達(dá)載體,并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行煙草轉(zhuǎn)化,共獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株19株,并通過(guò)PCR進(jìn)一步驗(yàn)證,表明煙草植株確定為轉(zhuǎn)基因LsF3’H和LsMYB4基因的煙草,但對(duì)于LsF3’H和LsMYB4基因的過(guò)表達(dá)對(duì)煙草的花色素苷合成的影響和作用有待進(jìn)一步研究