幽門螺桿菌微球疫苗制備及其免疫效應(yīng)研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Hp)是引起人類慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等的主要致病菌，現(xiàn)階段在全世界人群中的感染率達(dá)50％以上，目前臨床上常用的三聯(lián)療法不足以根治Hp感染，且費(fèi)用昂貴、病人依從性差、容易復(fù)發(fā)及產(chǎn)生耐藥菌株。疫苗接種是徹底消除Hp感染的有效措施之一，根據(jù)共同粘膜免疫系統(tǒng)(CMIS)理論及文獻(xiàn)報(bào)道，口服途徑是其中最簡(jiǎn)單、直接、安全且有效的給藥方式，但必須克服消化道中大量酸性、酶類物質(zhì)對(duì)抗原破壞的問題。 近年來，以微球(microsp

2、here，MS)、微囊、脂質(zhì)體等為代表的緩釋、控釋給藥制劑研究得到迅猛發(fā)展，它不僅能耐受各種復(fù)雜生理環(huán)境，而且還具有靶向給藥的特點(diǎn)。其靶向性決定于制劑本身粒徑大小，有文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)粒徑為1μm至10μm之間的MS經(jīng)口服后，既可以產(chǎn)生全身免疫，也可以在局部粘膜形成有效的免疫應(yīng)答。另外，由于MS具有顯著的緩釋特性，能夠使藥物在靶器官形成長(zhǎng)時(shí)間的有效濃度，因此可以在一定程度上減少疫苗的免疫劑量及免疫次數(shù)。 Hp疫苗免疫保護(hù)機(jī)理的深入探討對(duì)

3、于Hp的有效防治及疫苗的研發(fā)會(huì)起到較大的推定作用。目前盡管對(duì)其進(jìn)行了大量的研究，但其確切機(jī)制尚不清楚。本研究以Hp全菌蛋白(HpWCP)為抗原成分，主要從MS制備工藝及特征分析、免疫效應(yīng)、免疫保護(hù)及保護(hù)機(jī)理等三個(gè)方面進(jìn)行了研究。 (一)HpWCP-CAMS的制備及其表征分析在本研究中，采用生物可降解天然高分子物質(zhì)—?dú)ぞ厶?chitosan，CTS)、海藻酸鈉(sodiumalginate，AGS)為MS主要制備材料，通過系統(tǒng)考察

4、制備材料水溶液的流動(dòng)性、粘稠度、穩(wěn)定性等結(jié)果確定了AGS乳液濃度為2％、CTS濃度為1％、植物油與AGS乳液配比為2：8、CaCl2溶液反滴滴定法等MS制備工藝參數(shù)及程序。在此基礎(chǔ)上，對(duì)影響MS粒徑大小的因素進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)分析，并以確定的攪拌速率800rpm、藥物濃度2mg/ml、制備溫度25℃、攪拌時(shí)間30min等參數(shù)制備出平均粒徑為3.33μm殼聚糖—海藻酸鈉包裹牛血清白蛋白微球(BSA-CAMS)，其平均載藥量為31.5％，平均藥物

5、包封率為61.0％。電鏡觀察所得MS表面光整、大小均一。體外釋藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示此MS具有良好的緩釋功能，最長(zhǎng)釋藥時(shí)間可達(dá)到20d以上。在人工胃液中觀察其具有強(qiáng)耐酸性且對(duì)所包裹的蛋白抗原具有很好的保護(hù)效果，分別用3H-TdR和FITC標(biāo)記被包裹蛋白進(jìn)行MS體內(nèi)靶向?qū)嶒?yàn)分析，發(fā)現(xiàn)MS主要靶向至腸道粘膜組織并能夠被巨噬細(xì)胞吞噬。 以HpWCP作為主要的抗原成分采用上述工藝制備出殼聚糖—海藻酸鈉包裹Hp全菌蛋白微球(HpWCP-CAMS)

6、，經(jīng)檢測(cè)所制備MS平均粒徑3.58μm，載藥量為30.7％，包封率為63.5％，釋藥時(shí)間20d。體外毒性試驗(yàn)顯示MS在5mg/ml濃度下，每實(shí)驗(yàn)孔加入125μl作用72h仍不會(huì)對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)造成影響。體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)小鼠生長(zhǎng)健康，無異常反應(yīng)。凍干樣品能夠在25℃±2℃、濕度75％±5％及6℃±2℃、濕度60％±10％條件下穩(wěn)定存在，說明凍干品具有良好的穩(wěn)定性。小鼠致敏淋巴細(xì)胞試驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)小鼠在MS免疫后2w，其體內(nèi)淋巴細(xì)胞就已經(jīng)

7、對(duì)抗原致敏，并且8w后仍具有較好的致敏性。 (二)HpWCP-CAMS免疫效應(yīng)研究針對(duì)HpWCP-CAMS的免疫效果研究，我們?cè)O(shè)計(jì)了7個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較：?jiǎn)渭兊腍pWCP組(Ⅰ組)；HpWCP+CTS+AGS組(Ⅱ組)；HpWCP-CAMS組(Ⅲ組)；HpWCP+rLT組(Ⅳ組)；HpWCP+CTS+AGS+rLT(重組大腸桿菌不耐熱腸毒素)組(Ⅴ組)；HpWCP-CAMS+rLT組(Ⅵ組)及PBS對(duì)照組(Ⅶ組)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HpWC

8、P-CAMS不加佐劑組(Ⅲ組)血清特異性IgG均值為0.959±0.161、IgA均值為0.799±0.153；胃粘膜洗液中sIgA均值為0.964±0.165，腸粘膜洗液中sIgA檢測(cè)均值為1.036±0.324。以上結(jié)果與Ⅵ組結(jié)果相差不顯著(p＞0.05)，與Ⅳ組、Ⅴ組結(jié)果比較相差顯著(p＜0.05)，與Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅶ組結(jié)果相差非常顯著(p＜0.01)。在MS免疫劑量、免疫周期、免疫次數(shù)及免疫程序等實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，MS能夠改善常規(guī)H

9、p疫苗制劑所存在的不足：MS50μg蛋白劑量組誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平明顯高于常規(guī)蛋白組150μg劑量的抗體水平(p＜0.05)，而MS25μg蛋白劑量組誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平與常規(guī)蛋白組150μg劑量的抗體水平相差不顯著(p＞0.05)。免疫周期研究中發(fā)現(xiàn)以第0、14、30、60d抗體水平明顯高于第0、14、30、90d及第0、30、60、90d組抗體水平(p＜0.05)，而與第0、7、14、21d組抗體水平相差不顯著(p＞0.05)。免疫次數(shù)

10、實(shí)驗(yàn)中采用第0、14、30d分3次進(jìn)行免疫同樣也能夠得到比較好的免疫效果；在免疫程序比較實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用MS進(jìn)行口服途徑免疫時(shí)，不管是否服用胃酸中和液，其抗體水平?jīng)]有明顯變化(p＞0.05)，說明MS本身具有很好的抗酸性，此結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。由此我們可以得出，MS的靶向、緩釋的特點(diǎn)能夠使其克服傳統(tǒng)Hp疫苗免疫程序復(fù)雜、抗原用量大、免疫效果不肯定等諸多不足和缺陷。 (三)HpWCP-CAMS免疫保護(hù)試驗(yàn)及免疫保護(hù)機(jī)理初探在小鼠

11、攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)中，在全程免疫后2w、5w、10w分別對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，2w后采用組織直接涂片、組織培養(yǎng)、HpDNA抽提后PCR擴(kuò)增、糞便Hp全菌ELISA檢測(cè)等四種方法對(duì)感染效果進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示在3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)免疫后小鼠的免疫保護(hù)率分別達(dá)到94.4％、89.4％及94.7％，而對(duì)照組小鼠Hp感染率均在90％以上，說明HpWCP-CAMS能夠使小鼠得到很好的免疫保護(hù)效果。 在免疫保護(hù)機(jī)理探討實(shí)驗(yàn)中，我們采用RT-PCR、ELIS

12、POT及流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞及基因水平的研究，在對(duì)脾臟及PP結(jié)內(nèi)IgA-ASC及IgG-ASC數(shù)量研究中發(fā)現(xiàn)，脾臟內(nèi)抗原特異性IgA-ASC數(shù)量由對(duì)照組的(0.99±0.14)×103/105上升為(5.24±0.85)×103/105，與對(duì)照組相差顯著(p＜0.05)，IgG-ASC水平由原來的(1.22±0.21)×103/105上升為(10.35±1.02)×103/105，與對(duì)照組相差非常顯著(p＜0.01)。小腸PP結(jié)內(nèi)IgA-

13、ASC的水平也由原來的(1.63±0.32)×103/105上升為(11.06±2.31)×103/105，與對(duì)照組相差非常顯著(p＜0.01)；IgG-ASC水平由原來的(1.02±0.35)×103/105上升為(5.69±1.06)×103/105，與對(duì)照組相差顯著(p＜0.05)。在對(duì)IL-4、IFN-γmRNA基因表達(dá)水平進(jìn)行比較研究中發(fā)現(xiàn)，免疫后的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)兩細(xì)胞因子mRNA水平均有較大程度的升高，說明HpWCP-C

14、AMS所誘導(dǎo)的保護(hù)性免疫應(yīng)答是TH1和TH2型反應(yīng)平衡作用的結(jié)果；采用流式細(xì)胞儀分析免疫后小鼠外周血發(fā)現(xiàn)，代表成熟T細(xì)胞總數(shù)的CD3+細(xì)胞以及其主要成分CD4+細(xì)胞分別由67.2％和31.8％上升到73.2％和42.9％，較對(duì)照組均有顯著升高(p＜0.05)，而CD8+細(xì)胞升高不明顯(p＞0.05)，考察機(jī)體免疫水平的CD4+/CD8+的比值也有一定程度升高，抑制性T細(xì)胞CD4+CD25+T細(xì)胞由10.3％上升到14.5％，較對(duì)照組升高

15、顯著(p＜0.05)，以上結(jié)果說明小鼠細(xì)胞免疫水平有所增強(qiáng)，說明Hp疫苗的免疫保護(hù)作用與細(xì)胞免疫有直接關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中代表成熟B細(xì)胞總數(shù)的CD19+細(xì)胞數(shù)量由12.3％上升到18.6％，較對(duì)照組相差顯著(p＜0.05)，進(jìn)一步驗(yàn)證了Hp疫苗的免疫保護(hù)機(jī)制是體液免疫與細(xì)胞免疫共同起作用的結(jié)果。 結(jié)論：通過上述實(shí)驗(yàn)研究制備出粒徑約為3.58μm的HpWCP-CAMS，其具有靶向腸道PP結(jié)組織的特性，具有良好的抗酸性及藥物緩釋功能，凍干