家蠶微孢子蟲總蛋白雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)分析平臺(tái)的構(gòu)建.pdf

1、微孢子蟲是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的病原微生物，它能寄生于包括人在內(nèi)幾乎所有的動(dòng)物體內(nèi)。家蠶微孢子蟲能感染家蠶引起家蠶微粒子病，是蠶業(yè)生產(chǎn)上一種重點(diǎn)控制的蠶病。家蠶微孢子蟲蛋白質(zhì)組學(xué)研究以總蛋白為研究對(duì)象，主要采用雙向電泳技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)以及生物信息學(xué)技術(shù)，獲得家蠶微孢子蟲蛋白質(zhì)雙向電泳參考圖，通過質(zhì)譜分析，鑒定蛋白質(zhì)，以期找到與微孢子蟲侵染、增殖及代謝等重妻生理過程相關(guān)的蛋白質(zhì)，為家蠶微孢子蟲的基礎(chǔ)研究積累更多的知識(shí)。 1．成熟家蠶微

2、孢子蟲總蛋白提取方法的建立。提取家蠶微孢子蟲蛋白質(zhì)的方法主要有化學(xué)與物理的方法，化學(xué)方法是利用0.1mol/LK<,2>CO<,3>溶液在27℃條件下刺激微孢子蟲彈出極管，釋放出的孢原質(zhì)破裂，然后獲取蛋白質(zhì)，此方法簡(jiǎn)單且提取的蛋白質(zhì)含量較豐富，但樣品中含有大量的鹽離子。物理方法主要是采用液氮反復(fù)凍融結(jié)合研磨，破碎幾丁質(zhì)外壁，用蛋白質(zhì)抽提液抽提，從而得到蛋白質(zhì)，此方法較煩瑣，但得到的蛋白質(zhì)含量豐富且樣品中鹽離子濃度極低，適用于雙向電泳，且

3、電泳效果較好。 2．家蠶微孢子蟲雙向電泳參考圖譜的建立。通過雙向電泳，我們得到一張比較完整的家蠶微孢子蟲蛋白質(zhì)圖譜，通過Image master軟件分析，可識(shí)別的蛋白點(diǎn)有267個(gè)。多數(shù)蛋白質(zhì)分子量集中在45KD以下，各pH段都有分布，小分子量蛋白質(zhì)種類豐富，而大分子量的蛋白質(zhì)含量較少，特別是堿性區(qū)域的大分子量蛋白質(zhì)極少。 3．家蠶微孢子蟲本地蛋白質(zhì)檢索數(shù)據(jù)庫的建立及蛋白質(zhì)譜鑒定。根據(jù)家蠶微孢子蟲全基因組數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)出的編碼序

4、列，利用GPMAW軟件，建立本地蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。從雙向電泳圖譜共挖點(diǎn)295個(gè)(包括重復(fù)挖點(diǎn))，通過MALDI-TOF-MS鑒定出的蛋白質(zhì)點(diǎn)有80個(gè)，除去重復(fù)后的蛋白質(zhì)點(diǎn)有50個(gè)，其中有功能信息的蛋白質(zhì)有28個(gè)，hypothetical protein有9個(gè)，未知蛋白有13個(gè)。對(duì)有功能信息的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其功能涉及到微孢子蟲的基本生理活動(dòng)，包括蛋白質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)座、細(xì)胞骨架、細(xì)胞修復(fù)、死亡、老化、細(xì)胞生長(zhǎng)、胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)合成等