枯草芽孢桿菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建和分泌表達(dá)研究.pdf

1、利用食品級(jí)微生物所構(gòu)建的基因重組表達(dá)系統(tǒng)被稱為食品級(jí)重組微生物表達(dá)系統(tǒng)，簡(jiǎn)稱食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)。與一般表達(dá)系統(tǒng)相比，其顯著特點(diǎn)是所采用的材料完全來自于食品安全菌種，故該類表達(dá)系統(tǒng)可以直接應(yīng)用于發(fā)酵食品和食品加工過程，在食品工業(yè)中有巨大的應(yīng)用潛力?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)是一種食品級(jí)微生物，可以被開發(fā)成一種食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)，其特點(diǎn)是可以分泌大量蛋白質(zhì)到胞外，對(duì)其蛋白質(zhì)分泌信號(hào)肽、分泌途徑的研究，可克服分泌中存在的瓶頸，

2、有可能將其改造成為一種高效的外源蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌種。 本論文以枯草芽孢桿菌為研究對(duì)象，首次構(gòu)建了基于該菌種的兩個(gè)食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)，并對(duì)它們的表達(dá)性能、遺傳穩(wěn)定性指標(biāo)進(jìn)行了詳細(xì)研究。然后采用枯草芽孢桿菌的雙精氨酸蛋白質(zhì)分泌信號(hào)肽進(jìn)行了胞內(nèi)酶的分泌表達(dá)研究。最后對(duì)枯草芽孢桿菌蛋白質(zhì)分泌途徑的改造進(jìn)行了初步研究。主要研究結(jié)果如下： 克隆了枯草芽孢桿菌丙氨酸消旋酶基因dal，結(jié)果表明其可以互補(bǔ)D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢桿菌QB928株

3、，將其同時(shí)作為食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)重組子選擇標(biāo)記和單交換同源重組整合的同源區(qū)，構(gòu)建了基于染色體整合方式的枯草芽孢桿菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)。將來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌(Geobacillus．stearothermophilus)的耐熱p半乳糖苷酶BgaB克隆到該表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)，重組表達(dá)菌株的生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)量與出發(fā)菌株基本一致，其在搖瓶發(fā)酵中BgaB最高酶活達(dá)到0.16 U/(mg protein)。對(duì)該食品級(jí)表達(dá)菌株的遺傳穩(wěn)定性分析表明，其在沒

4、有選擇壓力的情況下傳100代后，重組菌株的穩(wěn)定性為98％。 構(gòu)建了基于可復(fù)制載體的枯草芽孢桿菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)。首先敲除168株染色體上的dal基因表達(dá)單元以構(gòu)建D-丙氨酸缺陷型食品級(jí)宿主菌株FG01。然后以基因dal作為選擇標(biāo)記，以新型Theta型復(fù)制子作為食品級(jí)表達(dá)載體的骨架，以啟動(dòng)子P43作為外源基因表達(dá)用啟動(dòng)子，構(gòu)建了食品級(jí)表達(dá)質(zhì)粒pXFGT03和pXFGT05，其中pXFGT05是pXFGT03刪除了復(fù)制子中兩個(gè)開放閱讀

5、框ORF-3和ORF-4后的衍生物，研究結(jié)果表明刪除該兩個(gè)開放閱讀框?qū)τ谫|(zhì)粒的復(fù)制功能沒有明顯影響。 將BgaB的編碼基因bgaB分別克隆到質(zhì)粒pXFGT03和pXFGT05中得到質(zhì)粒pXFGT03-bgaB和pXFGT05-bgaB，此二質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌株FG01中得到食品級(jí)重組表達(dá)菌株FG01(pxFGT03-bgaB)和FG01(pxFGT05-bgaB)。對(duì)此二菌株的搖瓶發(fā)酵和酶活測(cè)定表明，它們表達(dá)的BgaB酶活量大致相

6、當(dāng)，在13 h時(shí)，酶活分別達(dá)到1.90 U/(mgprotein)和2.01 U/(mg protein)，是整合表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的BgaB酶活最大值的10倍以上。對(duì)此二質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和分離穩(wěn)定性的研究表明，在沒有選擇壓力的情況下傳100代后，其穩(wěn)定性均為100％。 將基因bgaB與枯草芽孢桿菌中性蛋白酶NprB的信號(hào)肽編碼序列拼接并構(gòu)建了分泌表達(dá)質(zhì)粒pMKSigbgaB01，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到168株后進(jìn)行了BgaB的表達(dá)研究，結(jié)果表明該信

7、號(hào)肽不能夠有效引導(dǎo)BgaB的分泌。將基因bgaB與磷酸二酯酶PhoD的信號(hào)肽編碼序列拼接并構(gòu)建了分泌表達(dá)質(zhì)粒pMKSigbgaB03，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入168株后可以在低磷酸鹽培養(yǎng)基中利用Tat分泌途徑分泌BgaB。將該信號(hào)肽和目標(biāo)基因的融合片段克隆到啟動(dòng)子P<,HpaⅡ>控制之下得到分泌表達(dá)質(zhì)粒pMASigbgaB05。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入168株后，可在豐富培養(yǎng)基中分泌表達(dá)BgaB，在重組菌株發(fā)酵培養(yǎng)的8-18 h中，上清液中的BgaB酶活占總酶活