禽致病性大腸桿菌IMT5155毒力基因片段E9的克隆表達(dá)及生物學(xué)特性分析.pdf

1、禽大腸桿菌病(Avian colibacillosis)是指由致病性大腸桿菌引起禽類(lèi)的急性、慢性傳染病的總稱(chēng)。禽致病性大腸桿菌(avian pathogenic Escherichia coli，APEC)的優(yōu)勢(shì)血清型為O1：K1、O2：K1和O78：K80，其毒力因子有：脂多糖復(fù)合物、英膜、黏附素、溫度敏感血凝素、鐵攝取系統(tǒng)、外膜蛋白、毒素、AGI-3基因組島、侵襲素，Pst系統(tǒng)等。毒力基因片段E9、F11為禽高致病性大腸桿菌IMT5

2、155株與禽非致病性大腸桿菌CFT073株通過(guò)抑制差減雜交(SSH)獲得的其中兩片段，本研究對(duì)其進(jìn)行了克隆、序列分析，并對(duì)E9片段進(jìn)行表達(dá)及特性分析。 1.經(jīng)BLAST比對(duì)，參考已知序列，以PCR擴(kuò)增禽致病性大腸桿菌IMT5155的基因片段E9、F11所在的閱讀框，并將其插入到pMD18-T Simple Vector載體中，構(gòu)建克隆載體pMD-E9/F11?？寺〉幕蚱伍L(zhǎng)度分別為750bp、1917bp，編碼250、639個(gè)

3、氨基酸。與不同基因型部分代表株氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，同源性均很高。用DNAStar Protean分析，IMT5155毒力基因片斷E9、F11與其它株相應(yīng)片斷抗原性預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。 2.對(duì)克隆栽體pMD-E9進(jìn)行雙酶切，將得到的7500p片段以正確的閱讀框架定向克隆于pET-28a中，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主菌BL21( DE3)中，在37℃1.0 mM IPTG誘導(dǎo)下該片段獲得良好表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE鑒定，其表達(dá)的融合

4、蛋白約為32.2kD，與預(yù)期值一致。Western blot分析顯示，該表達(dá)蛋白能與IMT5155全菌制備的兔抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明其具有一定的免疫反應(yīng)性。 3.用蛋白純化試劑盒HisTrapTM HP純化表達(dá)蛋白后得到單一的目的蛋白約32.2kDa，與預(yù)期值一致。將上述純化的蛋白免疫新西蘭兔，獲得免疫血清，經(jīng)方陣滴定試驗(yàn)后間接ELISA檢測(cè)，該抗血清的效價(jià)為1：6400。進(jìn)一步分析重組蛋白的相關(guān)生物學(xué)功能，分別進(jìn)行了細(xì)胞毒

5、性試驗(yàn)、動(dòng)物試驗(yàn)、細(xì)胞黏附與黏附抑制試驗(yàn)。結(jié)果表明，該蛋白沒(méi)有細(xì)胞毒性，對(duì)小鼠亦無(wú)毒性，有一定的黏附作用。 4.將純化的重組蛋白和全菌用ISA206乳化制成疫苗免疫雛雞，二免后一周，用試驗(yàn)菌株IMT5155氣囊注射攻毒，同時(shí)設(shè)立非免疫雞只攻毒對(duì)照和非免疫非攻毒對(duì)照。攻毒1日后，非免疫攻毒組死亡率為90％，重組蛋白免疫組死亡率為60％，而全菌免疫的死亡率達(dá)80％。所有試驗(yàn)組雞群剖解，從肝和心等部位觀察機(jī)體的病理變化，免疫攻毒的兩組