EBV反式激活因子Zta和Rta促進(jìn)Raji細(xì)胞從G-,0--G-,1-期到S期的轉(zhuǎn)變.pdf

1、近年來(lái)已經(jīng)比較清楚的是小DNA病毒，如猿猴病毒40（SV40）或乳頭瘤病毒與細(xì)胞周期相互影響，在病毒進(jìn)入復(fù)制裂解期的同時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)入S期，這些病毒不能編碼DNA復(fù)制時(shí)所需要的聚合酶或其它輔助因子，所以就改變或利用細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制，支持病毒DNA的復(fù)制。而皰疹病毒類如EB病毒，有一套能編碼病毒DNA聚合酶及其輔助因子的基因體系，復(fù)制系統(tǒng)相對(duì)獨(dú)立，與猿猴病毒40或乳頭瘤病毒不同，皰疹病毒并不需要S期的環(huán)境支持病毒復(fù)制。皰疹病毒家族不同

2、成員間這種功能的保守性表明，這是皰疹病毒復(fù)制策略的組成部分。此外，皰疹病毒裂解復(fù)制過(guò)程對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控也涉及到一系列病毒蛋白，進(jìn)一步揭示了這種功能在病毒生命周期的重要作用。
　　 EB病毒（Epstein-BarrVirus，EBV）是具有嗜B細(xì)胞特性的γ皰疹病毒類，人群中造成最廣泛感染的病毒種類之一。研究表明，90～95％以上的不同人種均有EBV感染史，大量的臨床研究表明，EBV與多種惡性腫瘤如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、胃

3、癌等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。此外，EBV感染帶來(lái)的嚴(yán)重問(wèn)題尚包括移植后淋巴增殖性疾病（post-transplantlymphoproliferativedisease，PTLD）。EBV主要感染人B細(xì)胞和上皮細(xì)胞，EBV在宿主細(xì)胞中以兩種形式存在：潛伏期和裂解期。EBV在其生命周期中使用兩組相對(duì)獨(dú)立的基因執(zhí)行不同的功能，在宿主細(xì)胞內(nèi)，潛伏期基因通過(guò)激活細(xì)胞周期進(jìn)程導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限增殖，這也解釋了在EBV感染導(dǎo)致的腫瘤中總是能發(fā)現(xiàn)潛伏期基因的表

4、達(dá)。潛伏期蛋白表達(dá)與細(xì)胞周期進(jìn)展的關(guān)系已經(jīng)確立，但是裂解期蛋白與細(xì)胞周期的關(guān)系仍然不清楚。
　　 研究表明，與潛伏期蛋白表達(dá)環(huán)境不同，裂解復(fù)制過(guò)程更依賴于EBV編碼的立早蛋白。當(dāng)被重新激活時(shí)，EB病毒立早（IE）裂解基因BZLF1和BRLF1開(kāi)始表達(dá)。這些基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子會(huì)激活病毒和胞內(nèi)基因的啟動(dòng)子，結(jié)果導(dǎo)致下游基因瀑布式的激活包括早期基因、病毒基因組以及晚期基因。裂解復(fù)制周期更可能與非增值的細(xì)胞環(huán)境有關(guān)，比如在口腔上皮細(xì)胞，

5、裂解復(fù)制主要發(fā)生在分化良好的外層。但是，在這個(gè)系統(tǒng)中，很難確定是細(xì)胞生長(zhǎng)分化信號(hào)導(dǎo)致了病毒的裂解復(fù)制還是病毒的裂解復(fù)制影響了細(xì)胞周期進(jìn)程。但有研究表明EB病毒裂解基因產(chǎn)物Zta可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，并已經(jīng)形成關(guān)閉宿主細(xì)胞DNA復(fù)制的機(jī)制，然而EBV裂解周期過(guò)程調(diào)控細(xì)胞周期的機(jī)制尚不明確。綜上所述，本研究旨在探索EBV裂解期蛋白與宿主細(xì)胞周期的關(guān)系及其調(diào)控細(xì)胞周期的機(jī)制。
　　 我們利用B淋巴瘤細(xì)胞系Raji細(xì)胞作為本研究的主要模型

6、細(xì)胞，應(yīng)用TPA/NaB誘導(dǎo)Raji細(xì)胞中的EBV進(jìn)入裂解期，觀察到處于潛伏期感染的細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)阻滯和周期改變，Zta表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞主要富集在細(xì)胞周期G0/G1期，當(dāng)Zta的表達(dá)達(dá)到最大程度時(shí)，Zta陽(yáng)性細(xì)胞群部分重新進(jìn)入了S期。然而這種方法對(duì)分析單純EBV裂解期與宿主細(xì)胞的胞內(nèi)活動(dòng)不太嚴(yán)格，因?yàn)檫@很難區(qū)分是EBV裂解基因的影響還是化學(xué)誘導(dǎo)的作用，例如我們觀察到在EBV立早蛋白Zta表達(dá)前就出現(xiàn)了部分細(xì)胞G2/M期的阻滯。因此我們構(gòu)建了

7、Zta和Rta的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染表達(dá)后他們能有效激活EBV裂解期，對(duì)細(xì)胞周期的影響與誘導(dǎo)后的變化是一致的。通過(guò)對(duì)一系列細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的分析揭示了Raji細(xì)胞中Zta和Rta的表達(dá)干擾了細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制，Zta和Rta的表達(dá)明顯下調(diào)了Rb和p53的表達(dá)而上調(diào)了E2目的表達(dá)，進(jìn)一步分析了Rb的下調(diào)與其蛋白酶體降解途徑有關(guān)，而對(duì)p53和p21的調(diào)節(jié)表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上，結(jié)果提示：Zta和Rta的表達(dá)促進(jìn)了Raji細(xì)胞S期的進(jìn)程，并且進(jìn)一步揭