棕色脂肪組織來源的干細胞向起搏細胞的定向分化.pdf

1、用再生醫(yī)學(xué)的理念構(gòu)建生物心臟起搏器給病竇綜合征等嚴重緩慢型心律失常的治療帶來了新希望。目前,構(gòu)建生物心臟起搏器的方法主要有:基因轉(zhuǎn)染、細胞移植和組織工程體外構(gòu)建等。基因轉(zhuǎn)染的安全性及長期有效性有待解決,而細胞移植和組織工程方法均需要種子細胞-起搏樣細胞,所以尋找合適的種子細胞已成為構(gòu)建生物心臟起搏器的關(guān)鍵。
　　 目前,起搏細胞的來源包括:(1)成體細胞,如竇房結(jié)細胞,幼稚心臟細胞及轉(zhuǎn)基因的心肌細胞;(2)各類干細胞,可在體外或

2、體內(nèi)誘導(dǎo)成為起搏細胞,如胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)、誘導(dǎo)性多能干細胞(induced p luripotentstem cells,iPS)和成體干細胞(adult stem cell)等。其中,成體干細胞具有廣闊的臨床應(yīng)用前景,而其他細胞則存在細胞來源、免疫排斥、成腫瘤或倫理安全等問題。
　　 近年來的研究表明,脂肪間充質(zhì)干細胞(adipose-derived stem cells,ASC

3、s)和去分化脂肪細胞(dedifferentiated fat cells,DFAT)在體外能夠被誘導(dǎo)甚至自發(fā)分化為跳動的心肌細胞,然而,也有部分研究認為ASCs不能被誘導(dǎo)分化為心肌細胞。分析這些研究,我們認為誘導(dǎo)分化成功的關(guān)鍵除了培養(yǎng)分化條件外,還可能與脂肪組織的取材部位有關(guān),不同部位脂肪組織的差異可能導(dǎo)致了誘導(dǎo)分化結(jié)果的不一致。更重要的是,分化后跳動的心肌細胞是否是起搏細胞或是否具有起搏細胞的特征尚未得到證實。
　　 本研究

4、旨在明確脂肪組織常用取材部位肩胛間和腹股溝區(qū)脂肪組織的差異,以及其來源的干細胞向心肌細胞分化的能力,并驗證這種分化后細胞的起搏特征,為進一步構(gòu)建生物心臟起搏器奠定基礎(chǔ)。
　　 第一部分肩胛間和腹股溝皮下脂肪組織的特征及差異
　　 研究目的:研究小鼠肩胛間和腹股溝皮下脂肪組織的特征及差異。
　　 材料和方法:分別取小鼠肩胛間脂肪和腹股溝皮下脂肪,大體形態(tài)觀察兩種組織差別,組織切片HE染色觀察組織細胞構(gòu)成差異,透射電

5、鏡觀察脂肪細胞超微結(jié)構(gòu)。提取組織RNA,分析兩種脂肪組織基因表達。
　　 結(jié)果:大體形態(tài)觀察表明,小鼠肩胛間脂肪呈棕褐色,而腹股溝皮下脂肪外觀為亮白色。HE染色發(fā)現(xiàn),肩胛間脂肪含量大量棕色脂肪細胞,少量白色脂肪細胞混雜其中;腹股溝處皮下脂肪大部分為白色脂肪細胞,但淋巴結(jié)周圍有棕色脂肪細胞存在。棕色脂肪細胞小而含分散脂滴,白色脂肪細胞大,含單房脂滴。透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察,棕色脂肪細胞內(nèi)線粒體大而豐富,而白色脂肪細胞線粒體小且少?；?/p>

6、因表達分析,脂肪和心肌相關(guān)基因分別表達與脂肪組織和心肌組織中,個別心臟發(fā)育早期基因表達于脂肪組織中。
　　 結(jié)論:肩胛間部位脂肪組織主要為棕色脂肪,其中僅有少量白色脂肪;而腹股溝皮下脂肪組織主要為白色脂肪,在淋巴結(jié)周圍有棕色脂肪細胞分布。兩種脂肪細胞有明顯的形態(tài)學(xué)差異。
　　 第二部分棕色脂肪組織來源的干細胞向心肌細胞的定向分化
　　 研究目的:研究并比較來自白色和棕色脂肪的干細胞體外向心肌細胞分化的能力。

7、>　　 材料和方法:分別取腹股溝皮下白色脂肪和肩胛間棕色脂肪組織經(jīng)膠原酶消化離心后,取下層間充質(zhì)干細胞在20％FBS中常規(guī)培養(yǎng),取上層漂浮的成熟脂肪細胞經(jīng)天花板培養(yǎng)待貼壁或去分化后在20％FBS中常規(guī)培養(yǎng),免疫細胞化學(xué)方法及基因表達鑒定心肌細胞的標志物。
　　 結(jié)果:棕色脂肪來源的ASCs培養(yǎng)1周即可見有自發(fā)搏動的肌管狀細胞或小圓形細胞,自發(fā)搏動頻率大約130次/分鐘,表達α-actinin、troponin T/tropon

8、inI和Cx40等。而白色ASCs培養(yǎng)后呈現(xiàn)成纖維細胞樣改變,α-actinin為陰性,少量細胞Troponin T/Troponin I和Cx40弱陽性。棕色DFAT培養(yǎng)后3周后形成有肌管狀細胞并逐漸成片搏動,培養(yǎng)2周時即表達超極化激活環(huán)核苷酸門控通道(Hyperpo larization-act ivated cyclic nucleotide-gated channels,HCN)2、4和縫隙連接蛋白Cx45。而白色DFAT未見分

9、化為肌管狀細胞,培養(yǎng)2周時HCN2、HCN4和Cx45表達呈弱陽性。
　　 結(jié)論:來自棕色脂肪的ASCs和DFAT細胞在體外可以定向分化為自發(fā)搏動的心肌細胞,而來自白色脂肪的ASCs和DFAT細胞則不能。
　　 第三部分自發(fā)搏動心肌細胞的起搏細胞特征鑒定
　　 研究目的:研究來自棕色脂肪的干細胞分化的自發(fā)搏動的心肌細胞是否具有起搏細胞的特征。
　　 材料和方法:通過免疫細胞化學(xué)鑒定細胞起搏特征離子通道蛋白

10、HCN4的表達,細胞內(nèi)鈣成像檢測鈣瞬變,細胞膜片鉗檢測細胞的動作電位,藥理學(xué)檢測其心肌細胞的功能,透射電鏡觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果:棕色脂肪來源的ASCs和DFAT分化的自發(fā)搏動的心肌細胞均高表達HCN4。ASCs有自發(fā)鈣瞬變現(xiàn)象,并可記錄到其自發(fā)的動作電位。異丙腎上腺素(isoproterenol, ISO)或去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)可使搏動心肌細胞的搏動加快,而乙酰膽堿(acetylcho