正常氧干預對不同程度間歇缺氧大鼠腦組織損傷影響的研究.pdf

1、研究目的：
　　通過建立不同程度的間歇缺氧動物模型，模擬不同程度睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(SAHS)患者的缺氧狀態(tài)，研究不同程度間歇缺氧對大鼠腦細胞凋亡發(fā)生發(fā)展的意義;對缺氧動物模型實施21％氧干預后，觀察其對腦組織病理變化的影響，加深對SAHS的認識，為早期干預SAHS病情的發(fā)生與發(fā)展提供科學依據(jù);觀察對間歇缺氧進行21％氧干預后，大鼠腦內HIF-1，iNOS表達的變化，探討二者在間歇缺氧神經細胞凋亡中的作用，同時闡明這一變化對

2、評估缺血性腦血管疾病的治療價值的意義。
　　材料與方法：
　　健康SD大鼠42只，適應性飼養(yǎng)1周。實驗起始階段:42只中隨機選取6只作為0周的參考值（A組）。剩余36只大鼠隨機分為三組，對照組(n=12);輕度間歇缺氧組（n=12，相當于輕度OSAS，AHI=15）;重度間歇缺氧組(n=12，相當于重度OSAS，AHI=40)，各組以普通飼料、普通飲水飼養(yǎng)60天。每日9:00至16:00時將各組大鼠置于各實驗箱中，共7h，1

3、6:00后使大鼠生活于大氣環(huán)境中。各組在試驗30天后隨機取6只大鼠（BN組，BQ組，BZ組），予以取腦、原位細胞凋亡檢測(TUNEL)、電鏡檢查，應用免疫組化，Western Blot對腦內HIF-1α，iNOS進行蛋白水平的檢測。各組剩余大鼠（CN組，CQ組，CZ組）予以正常氧環(huán)境下繼續(xù)飼養(yǎng)，30天后行上述相同檢查。結果應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。
　　結果：
　　1.神經細胞形態(tài)學變化:
　　1.1 HE

4、染色光學顯微鏡下，神經細胞核呈藍黑色，胞漿呈淡紅色。A組，BN組SD大鼠海馬區(qū)可見數(shù)層錐體神經元，細胞形態(tài)規(guī)則;BQ，BZ各組中，從形態(tài)學觀察有不同程度的改變，海馬區(qū)錐體神經元出現(xiàn)核固縮、胞質濃縮、細胞體急劇變小等現(xiàn)象，以此判斷可能有細胞凋亡的發(fā)生。經過21％氧干預30天后，試驗結果發(fā)現(xiàn):干預組（CQ，CZ組）神經細胞凋亡情況有所好轉，但部分神經元細胞仍有排列不規(guī)則，形態(tài)改變的情況，未能恢復至初始水平。
　　1.2透視電鏡檢查發(fā)現(xiàn)

5、:經過30天間歇缺氧，間歇缺氧組的腦組織病理較正常氧組有顯著變化，且重度間歇缺氧組較輕度間歇缺氧組改變更為明顯，表現(xiàn)為大鼠腦組織神經細胞核雙層膜結構破壞，部分線粒體水腫擴張，細胞質中可見空泡。經過21％氧干預30天后，干預組神經細胞凋亡情況有所好轉，但部分神經細胞仍有細胞形態(tài)的變化，未能恢復至初始水平。
　　1.3 TUNEL實驗顯示:對照組（A組，BN組）SD大鼠海馬區(qū)可見神經細胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊緊密;缺氧組(BQ，BZ)中，

6、被染成棕黃色或棕褐色凋亡細胞增多，以重度間歇缺氧組增多最為明顯(14.83±2.48 VS18.67±2.66 VS32.67±4.18 VS49.17±4.36)。間歇缺氧組（BQ，BZ組）明顯高于對照組(A，BN組)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);輕度間歇缺氧組和重度間歇缺氧組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。經過21％氧干預30天后，試驗結果發(fā)現(xiàn):間歇缺氧干預組（CQ，CZ組）神經細胞凋亡情況有所好轉（24.00±

7、3.90 VS31.67±2.50），但未能恢復至初始水平。間歇缺氧干預組（CQ，CZ組）高于對照組（A，BN，CN組），差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);和缺氧組（BQ，BZ組）之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。凋亡神經細胞主要集中在海馬區(qū)，皮層。
　　2.iNOS表達的比較
　　常氧對照組（A，BN組）大鼠腦組織內散在分布少量iNOS陽性細胞（23.46±3.5501，24.17±1.4452）。在實驗組，不論是

8、輕度間歇缺氧組還是重度間歇缺氧組均可見較多的著色細胞（37.01±4.0473，53.34±8.0801）。間歇缺氧組（BQ，BZ組）明顯高于對照組（A，BN組），差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);輕度間歇缺氧組和重度間歇缺氧組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);經21％氧干預30天后，干預組（CQ，CZ組）腦內iNOS陽性染色細胞表達恢復至初始水平（24.6±8.1662，24.77±6.6268），干預組（CQ，CZ組）和

9、間歇缺氧組(BQ，BZ組)比較差異有統(tǒng)計學意義，和對照組（A，BN，CN組）比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。iNOS陽性染色細胞主要集中在大腦皮層及海馬區(qū)，不僅見于神經元，神經膠質細胞中亦有表達。
　　WesternBlot檢測結果顯示:缺氧后，實驗組（BQ，BZ組）iNOS較對照組(A，BN組)表達增多，以慢性重度間歇缺氧組最為明顯（140.01±1.7147 VS151.52±19.9948 VS376.52±38.92

10、34VS585.17±35.1067）。間歇缺氧組(BQ，BZ組)明顯高于對照組（A，BN組），差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);輕度間歇缺氧組（BQ組）和重度間歇缺氧組（BZ組）之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。經21％氧干預30天后，干預組（CQ，CZ組:170.59±42.5984，172.45±30.2081）和間歇缺氧組（BQ，BZ組）比較差異有統(tǒng)計學意義，和對照組(A，BN，CN組)比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05

11、)，各組腦內iNOS蛋白表達恢復至初始水平。
　　3.HIF-1α表達的比較
　　常對照組（A，BN組）大鼠腦組織內HIF-1α呈弱表達，在間歇缺氧組(BQ，BZ組)尤其是重度間歇缺氧組可見著色細胞明顯增多（12.35±4.7915 VS13.55±5.7289VS27.61±4.0600VS36.81±2.4887）。間歇缺氧組(BQ，BZ組)明顯高于對照組（A，BN組），差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);輕度間歇缺氧組和

12、重度間歇缺氧組之間比較差異有統(tǒng)計學意義((P＜0.01);經21％氧干預30天后，各組腦內HIF-1α陽性染色細胞表達恢復至初始水平，干預組（CQ，CZ組:13.70±5.2587，14.22±6.5862）和間歇缺氧組（BQ，BZ組）比較差異有統(tǒng)計學意義，和對照組（A，BN，CN組）比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。HIF-1α陽性染色細胞主要集中在海馬及皮層區(qū)。
　　WesternBlot檢測結果顯示:缺氧后，實驗組(BQ

13、，BZ組)HIF-1α較對照組（A，BN組）表達增多，以慢性重度間歇缺氧組最為明顯（112.60±11.2176 VS136.26±19.994VS338.25±81.6125 VS488.63±86.4614）。間歇缺氧組(BQ，BZ組)明顯高于對照組（A，BN組），差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);輕度間歇缺氧組（BQ組）和重度間歇缺氧組（BZ組）之間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。經21％氧干預30天后，干預組（CQ，C

14、Z組:158.44±10.631，167.79±34.505）和間歇缺氧組（BQ，BZ組）比較差異有統(tǒng)計學意義，和對照組(A，BN，CN組)比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，各組腦內HIF-1α蛋白表達恢復至初始水平。
　　結論：
　　1.間歇缺氧易誘導腦內特定部位神經細胞凋亡，主要表現(xiàn)為皮層和海馬區(qū)神經元細胞凋亡增加，這可能是SAHS導致認知功能障礙的主要原因。
　　2.不同缺氧方式所導致神經細胞凋亡的程度是不同

15、的，說明神經細胞的凋亡不僅僅是由缺氧本身所致，而且與缺氧的方式有關。
　　3.間歇缺氧有效刺激海馬區(qū)iNOS和HIF-1α的蛋白水平高表達，二者共同參與了神經系統(tǒng)缺氧應答反應。不同程度缺氧方式所導致神經細胞凋亡的程度是不同的，其HIF-1α及iNOS在腦內的蛋白表達也不同。
　　4.缺氧干預后，腦組織損傷有一定程度的改善，可能與機體內氧自由基代謝恢復平衡有關。缺氧程度不同，氧化應激強度不同，早期糾正缺氧，改善氧化應激狀態(tài)，可