禽致病性大腸桿菌ybjX、pagp缺失株生物學特性及其與PhoP的相關性研究.pdf

1、PhoP/Q二元調(diào)控系統(tǒng)廣泛存在于禽致病性大腸桿菌中，其可通過調(diào)控與內(nèi)毒素(LPS)相關基因的表達誘導應答基因的防御性表達。而應答基因的表達水平與APEC的自身致病力有很大關系?？箍咕幕?AMPR)通過直接或間接修飾LPS，改變細菌的外膜結構加強細菌抵抗宿主抗微生物因子的滲透能力，從而有助于對抗菌肽的抵抗。
　　本研究在前期基因芯片的基礎上篩選出可能與抗抗菌肽相關的基因ybjX、pagp，探究ybjX、pagp基因缺失對禽致病

2、性大腸桿菌生物學特性及兩個基因與PhoP相關性的研究。通過引物設計，PCR擴增結果表明，成功克隆出菌株中的ybjX、pagp序列并利用Red同源重組系統(tǒng)成功構建ybjX、pagp缺失株。在此基礎上利用質(zhì)粒pSTV28a構建了基因回復株。并對AE17與ybjX、pagp基因缺失株和回復株的生物學特性展開研究。在了解ybjX和pagp缺失對其生物學研究的基礎上進一步研究ybjX，pagp受PhoP的調(diào)控機制、以及對陽離子抗菌肽的抗性。具體研

3、究內(nèi)容和結果如下:
　　1.禽致病性大腸桿菌ybjX和pagp基因缺失株及回復株的構建
　　AE17（對氯霉素和氨芐青霉素敏感）為本實驗室保存的O2血清型禽致病性大腸桿菌菌株。本實驗利用Red同源重組技術對分別對ybjX基因和pagp基因進行缺失，成功構建兩株單基因缺失株（△ybjX和△pagp）并使用低拷貝質(zhì)粒pSTV-28a對兩株基因缺失株進行基因回復，成功構建基因回復株CybjX、Cpagp。
　　2.ybjX和

4、pagp基因缺失其生物學特性的評價
　　本實驗通過生長曲線的測定、運動性能力的檢測、環(huán)境耐受試驗和生物被膜形成能力檢測、外膜滲透性試驗、CEF細胞黏附和入侵試驗和LD50的測定，探索pagp和ybjX基因缺失株對APEC生物學特性的影響。在LB液體培養(yǎng)基中的生長性能ybjX基因缺失株和回復株較野生株未發(fā)生明顯改變;而相同條件下pagp基因缺失株和野生株生長性能比較發(fā)生明顯改變。運動性能力的檢測結果表明ybjX和pagp基因的缺失未

5、能影響AE17的運動性能力。環(huán)境耐受試驗表明ybjX、pagp缺失株對酸性環(huán)境的抵抗力較野生株分別降低2.2倍(p＜0.05)，4倍(p＜0.01);ybjX、pagp缺失株對堿環(huán)境的耐受力較野生株分別降低1.5倍、降低2倍(p＜0.05);ybjX、pagp缺失株對熱環(huán)境的耐受力降低10.4％(p＜0.01);pagp缺失株對熱環(huán)境的抵抗力較野生株降低19.2％;生物被膜實驗結果顯示ybjX缺失株生物被膜形成能力顯著降低是野生株的0.

6、75倍(p＜0.01);結果表明與野生株相比，pagp缺失株生物被膜形成能力顯著增強是野生株的1.4倍(p＜0.01)。
　　NPN試驗考察了兩個缺失株的細胞外膜滲透性。結果表明這兩個基因的缺失都能使APEC外膜滲透性增強。對APEC突變株的抗生素最小抑菌濃度和滲透性實驗結果較吻合。外膜滲透性較高的菌株對多粘菌素B和AVBD2表現(xiàn)出的敏感性較高。
　　本試驗通過對CEF細胞黏附和入侵能力的比較、LD50的測定探索了ybjX和

7、pagp基因缺失株對APEC致病力的影響。對雞胚成纖維細胞的黏附和入侵結果顯示，實驗結果表明ybjX缺失株對雞胚成纖維細胞的黏附、入侵能力能力與野生株相比分別降低了2.3倍、2倍(p＜0.01);pagp缺失株對雞胚成纖維細胞的黏附、入侵能力能力與野生株相比均升高了1.3倍(p＜0.01)（而互補株的黏附入侵能力則恢復到野生株水平）。半數(shù)致死量檢測結果顯示，對7日齡羅曼雞的半數(shù)致死量檢測結果表明ybjX和pagp缺失株對雞的致病力均下降

8、。
　　3.禽致病性大腸桿菌ybjX和pagp基因與PhoP蛋白的相關性分析
　　重組BL21-pET32a/phoP表達重組蛋白鑒定分子量為42.9KDa與其理論分子量相一致。并對表達的蛋白通過Ni-NTA親和層析柱純化進行純化。
　　在Genbank上查找APEC O1血清型的ybjX和pagp基因序列，利用Promoter prediction網(wǎng)站，預測ybjX、pagp兩個基因?qū)膯幼有蛄?，利用EMSA驗證

9、PhoP蛋白是否能夠結合上述兩個基因的啟動子。研究結果顯示ybjX、pagp受phop蛋白的間接調(diào)控。
　　4.AE17與ybjX和pagp缺失株對陽離子抗菌肽抗性的比較
　　本研究比較野生株、ybjX和pagp缺失株對多粘菌素B、AVBD2的敏感性。記錄抑菌圈的直徑結果表明兩個缺失株對多粘菌素B、AVBD2的抵抗能力都顯著降低。
　　通過以上實驗成功構建APEC ybjX和pagp單基因缺失株，結果顯示ybjX和pa

10、gp基因的缺失對CEF細胞和機體致病力均下降。證明了PhoP調(diào)控子對ybjX和pagp不能直接調(diào)控;ybjX和pagp缺失使AE17對抗菌肽的敏感性增強。初步證明了這些基因在禽致病性大腸桿菌中極可能參與抵抗宿主的先天性免疫防御，對生長代謝等的調(diào)控，如脂多糖的合成，細胞膜的形成以及藥物敏感性等。研究結果表明ybjX和pagp基因?qū)PEC的致病力及對抗菌肽的抵抗具有重要的影響，為深入研究APEC抵抗宿主先天性免疫防御機理奠定一定的研究基礎