MicroRNA-204-5p及其靶基因SIRT1在糖尿病角膜病變中的作用及機制研究.pdf

1、糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是一組以慢性血糖水平增高為特征的代謝性疾病，是由于胰島素分泌和（或）作用缺陷所引起。近年來糖尿病發(fā)病率持續(xù)增高，人們?nèi)找鎸μ悄虿〖捌洳l(fā)癥防治予以重視。在眼科領(lǐng)域，糖尿病角膜病變在糖尿病患者比較常見，糖尿病患者眼部手術(shù)術(shù)后角膜上皮的遷延不愈是臨床棘手的難題。糖尿病角膜病變主要臨床表現(xiàn)為淺層點狀角膜炎或持續(xù)性上皮缺損以及角膜知覺的減退。很多研究表明角膜上皮基底膜的異常增厚和角膜上皮細(xì)胞功能

2、改變共同導(dǎo)致了糖尿病角膜病變。目前糖尿病角膜病變的發(fā)病機制尚不明確，其發(fā)生的機制以及治療對策仍是臨床中亟待解決的科學(xué)問題。
　　沉默信號調(diào)控因子1（silence signal regulating factor1，SIRT1）是一種組蛋白脫乙?；?，參與糖代謝和胰島素分泌等多條代謝通路，被認(rèn)為是治療糖尿病的新靶點。已有研究證實SIRT1在糖尿病角膜中表達顯著下調(diào)，過量表達SIRT1后可以顯著促進糖尿病小鼠角膜上皮的損傷修復(fù)。但引

3、起糖尿病角膜SIRT1表達下調(diào)的原因尚不清楚。
　　MicroRNAs(miRNAs，miRs)是一類長度約為22個核苷酸（nucleotide，nt）的內(nèi)源性非編碼RNA，通過與其靶蛋白的3端非編碼區(qū)(Untranslated Regions，UTRs)區(qū)結(jié)合，完成轉(zhuǎn)錄后水平的基因調(diào)控。它參與了多個生物學(xué)進程如發(fā)育、細(xì)胞死亡、細(xì)胞增殖、中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能及腫瘤形成等。它能通過調(diào)控眾多靶基因從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。目前對miRNAs的研

4、究雖廣泛，但有關(guān)糖尿病角膜病變的miRNAs研究少且不深入。因此本研究選擇圍繞SIRT1這一糖尿病的重要靶點，擬從表觀遺傳學(xué)的角度探討是否在角膜組織中存在某種或某些miRNAs，它能否通過影響SIRT1的表達進而改變糖尿病角膜上皮的損傷修復(fù)能力。
　　本研究目的是篩選角膜上皮中可能調(diào)控SIRT1的miRNAs，探討所篩選出的miRNAs通過SIRT1在糖尿病角膜病變中的作用，以期探明其是否參與糖尿病角膜病變以及和提供新的治療靶點。

5、
　　第一部分篩選microRNAs及對靶基因SIRT1的作用研究
　　目的：篩選糖尿病角膜病變中調(diào)控Sirt1表達的microRNA（miRNA）
　　方法：采用生物信息學(xué)的方法預(yù)測調(diào)控 Sirt1的可能 miRNAs，通過實時定量 PCR(Quantitative Real time PCR，qRT‐PCR)的方法在糖尿病小鼠角膜上皮組織進行驗證；采用miRNA的模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染正常小鼠角膜緣上皮干/祖細(xì)胞系(T

6、KE2)細(xì)胞，從而實現(xiàn)miRNA在TKE2細(xì)胞的過量或者下降的表達
　　結(jié)果：從生物信息學(xué)結(jié)果中挑選出9個 miRNAs用于其后的 qRT‐PCR的驗證，其中miR‐204‐5p用于后續(xù)的研究，與非糖尿病的對照小鼠角膜上皮組織相比，其表達是糖尿病角膜上皮組織的5.16倍。正常TKE2轉(zhuǎn)染miR‐204‐5p的模擬物或抑制物后，SIRT1表達顯著下調(diào)或上調(diào)。雙熒光素酶報告基因分析結(jié)果顯示miR‐204‐5p的靶基因是Sirt1。結(jié)論

7、：在糖尿病角膜中miR‐204‐5p表達顯著上調(diào)。MiR‐204‐5p能負(fù)性調(diào)控SIRT1，其高表達是導(dǎo)致糖尿病角膜上皮中Sirt1低表達的原因之一。
　　第二部分調(diào)控microRNA‐204‐5p通過SIRT1促進高糖環(huán)境下小鼠角膜緣上皮干/祖細(xì)胞系(TKE2)細(xì)胞周期循環(huán)
　　目的：探究miR‐204‐5p通過SIRT1是否能影響因高糖而被阻滯TKE2細(xì)胞周期循環(huán)。
　　方法：MiR‐204‐5p的抑制劑轉(zhuǎn)染高糖環(huán)

8、境下的TKE2細(xì)胞：qRT‐PCR/Western blot檢測SIRT1，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、p21、p16的表達；MTT法檢測細(xì)胞增殖變化；PI染色法流失細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化。
　　結(jié)果：TKE2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR‐204‐5p的抑制物后顯著促進了高糖環(huán)境下細(xì)胞生長與細(xì)胞周期的循環(huán)，Sirt1與Cyclin D1的表達上調(diào)，而p16的表達下調(diào)。
　　結(jié)論：抑制miR-204-5p的表達，可通過對Sirt1的

9、調(diào)控，促進高糖環(huán)境下被阻滯的角膜上皮細(xì)胞周期循環(huán)
　　第三部分調(diào)控 microRNA‐204‐5p通過 SIRT1促進糖尿病小鼠 C57BL/6J‐INS2Akita（INS2Akita/+）角膜上皮損傷修復(fù)究
　　目的：探究在糖尿病角膜中miR‐204‐5p通過SIRT1是否能影響角膜上皮損傷修復(fù)。
　　方法：建立機械性角膜上皮損傷小鼠動物模型，結(jié)膜下注射 miR‐204‐5p，觀察建模成功后0‐72小時內(nèi)角膜上皮缺

10、損面積，用于評價該miRNA對糖尿病角膜上皮損傷修復(fù)的作用。qRT‐PCR/Western blot檢測角膜中SIRT1，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclin D1、p21、p16的表達。
　　結(jié)果：對Ins2Akita/+小鼠結(jié)膜下注射miR‐204‐5p的模擬物后，顯著促進了角膜上皮的損傷修復(fù)，該過程中SIRT1的表達增加，激活Cyclin D1/CDK1途徑，Cyclin D1的表達增加而p16的表達下降。
　　結(jié)論：抑制mi