靶向ICP4的RNA干擾對HSV-1病毒復制能力影響.pdf

1、單純皰疹病毒1型(HSV-1)為雙鏈包膜DNA病毒,具有親神經(jīng)的特性,在人群中感染廣泛。HSV-1感染外周神經(jīng)后可逆行跨越神經(jīng)元進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)并建立潛伏感染,病毒裂解后引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴重損傷。HSV-1基因組表達有很高時序性,分即早基因(IE),早期基因(E)和晚期基因(L)。作為IE基因產(chǎn)物之一的即早蛋白ICP4可刺激E基因表達和DNA合成,誘導L基因的表達,是HSV-1基因表達從而引發(fā)感染的關鍵激活因子。因此,有效抑制ICP4的

2、表達可以通過阻止HSV-1的復制達到治療HSV-1感染性疾病的目的。RNA干擾(RNAi)是一種細胞本身固有的對抗外源基因侵犯的自我保護現(xiàn)象,雙鏈RNA(dsRNA)分子在mRNA水平關閉相應序列及基因的表達使其沉默。在此基礎上建立的RNAi技術不僅僅是一種經(jīng)濟、快捷、高效的抑制基因表達的技術手段,更為研究者在基因功能測定和基因治療等方面開辟了新思路。
　　 本實驗構建表達ICP4 siRNA(小干擾RNA)的重組真核慢病毒質粒

3、PLKO.1-puro-ICP4-siRNA,將產(chǎn)生的重組病毒顆粒感染Vero細胞,建立穩(wěn)定表達ICP4 siRNA的重組Vero-ICP4-siRNA細胞系；進一步探討干擾HSV-1 ICP4基因后對HSV-1復制能力的影響,為臨床上運用RNAi治療HSV-1感染性疾病提供思路和實驗依據(jù)。
　　 目的:
　　 1建立穩(wěn)定表達ICP4特異性siRNA的重組細胞系。
　　 2初步分析靶向ICP4的siRNA對HSV

4、-1在Vero細胞中復制能力的影響。
　　 方法：
　　 1基因工程技術構建重組慢病毒質粒PLKO.1-puro-ICP4-siRNA,雙酶切及測序鑒定。
　　 2三質粒共轉染293T細胞產(chǎn)生重組慢病毒顆粒。
　　 3重組病毒顆粒感染Vero細胞,嘌呤霉素篩選法建立ICP4-siRNA表達陽性的重組細胞系。
　　 4采用Realtimc PCR和Western blot鑒定重組Vcro-ICP4-

5、siRNA細胞系。
　　 5通過觀察HSV感染重組Vero細胞后CPE(細胞病變效應)表達和TCID50(半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量)法測定HSV-1滴度,檢測靶向ICP4的siRNAs對HSV-1病毒復制能力的影響。
　　 結果：
　　 1成功構建重組真核慢病毒質粒PLKO.1-puro-ICP4-siRNA。
　　 2獲得有效濃度的穩(wěn)定表達ICP4的siRNAs的重組慢病毒顆粒。
　　 3成功建立穩(wěn)

6、定表達ICP4特異性siRNA的重組細胞系。
　　 4在mRNA和蛋白水平證實重組Vero-ICP4-siRNA細胞中的HSV-1 ICP4表達被抑制。
　　 5感染野生型HSV-1后,siRNA組Vero細胞的CPE表達率與陰性對照組比較有明顯降低。進一步采用TCID50法測定病毒滴度并對TCID值進行AVONA統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn),siRNA組HSV滴度與對照組存在顯著差異(P<0.001),siRNA組低于對照組；且針對