APE1特異性siRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其在人肝癌MHCC97-H細(xì)胞中APE1基因沉默效應(yīng)的觀察.pdf

1、目的：
　　 構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體LV-APE1-shRNA，觀察其介導(dǎo)的RNA干擾對(duì)人高侵襲肝癌細(xì)胞株MHCC97-H中APE1基因mRNA和蛋白的表達(dá)的影響，并進(jìn)行功能學(xué)檢測(cè)分析，為進(jìn)一步探討APE1在肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 設(shè)計(jì)4對(duì)干擾靶序列，分別與pGCSIL-GFP載體連接、轉(zhuǎn)化、并測(cè)序鑒定，將重組質(zhì)粒命名為KD1～KD4。通過Western blot篩選最

2、有效的靶點(diǎn)，將篩選到的重組質(zhì)粒與pHelper1.0，pHelper2.0共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝生產(chǎn)慢病毒顆粒并測(cè)定其病毒滴度。將包裝產(chǎn)生的慢病毒顆粒感染MHCC97-H細(xì)胞，通過RT-PCR和Westem blot檢測(cè)其干擾效率，通過免疫細(xì)胞化學(xué)觀察APE1表達(dá)的定位變化；利用噻唑蘭比色(MTT)方法檢測(cè)APE1干擾前后MHCC97-H細(xì)胞的增殖能力的變化；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)APE1基因抑制后MHCC97-H細(xì)胞的周期變化

3、；應(yīng)用體外黏附實(shí)驗(yàn)觀察APE1基因抑制前后MHCC97-H細(xì)胞黏附能力的變化；通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察APE1基因抑制前后，MHCC97-H細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)能力和侵襲能力的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過PCR篩選陽性克隆和DNA測(cè)序鑒定，與設(shè)計(jì)的序列一致，通過Westem blot篩選到KD3的干擾效率達(dá)90％以上。將KD3與pHelper1.0，pHelper2.0共轉(zhuǎn)染腎胚293T細(xì)胞，包裝生產(chǎn)慢病毒顆

4、粒LV-APE1-shRNA，測(cè)定其病毒滴度為4x108TU/mL。
　　 2.LV-APE1-shRNA感染MHCC97-H細(xì)胞后，APE1基因的mRNA和蛋白的表達(dá)量與未感染組和空載體病毒感染組相比均明顯下降，免疫細(xì)胞化學(xué)顯示APE1的表達(dá)從胞核、胞質(zhì)表達(dá)轉(zhuǎn)移至僅部分胞核弱表達(dá)。
　　 3.體外增殖實(shí)驗(yàn)顯示：與未感染組和空載體病毒感染組相比，LV-APE1-shRNA感染MHCC97-H細(xì)胞后，MHCC97-H細(xì)胞的

5、體外增殖能力下降。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)顯示：與未感染組和空載體病毒感染組相比，LV-APE1-shRNA感染MHCC97-H細(xì)胞后，細(xì)胞的G1期延長，而G2期和S期相對(duì)縮短。
　　 4.在體外黏附、侵襲和趨化運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)中，與未感染組和空載體病毒感染組相比，LV-APE1-shRNA組的MHCC97-H細(xì)胞的黏附能力、侵襲能力及趨化運(yùn)動(dòng)能力均不同程度的下降。
　　 結(jié)論：
　　 1.本課題所構(gòu)建的慢病毒載體可顯著、穩(wěn)定的抑制