肺癌中14-3-3σ和hASH1表達(dá)關(guān)系及14-3-3σ表達(dá)與肺腺癌臨床病理參數(shù)關(guān)系.pdf

1、14-3-3σ是14-3-3蛋白家族中的一員，14-3-3σ直接參與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，在多種人類惡性腫瘤中常有其蛋白或基因表達(dá)異常。hASH1基因是human achaete-scute homologue 1的簡稱，是bHLH（basic helix-loop-helix）基因家族成員之一，bHLH蛋白構(gòu)成多個轉(zhuǎn)錄因子家族，這些轉(zhuǎn)錄因子參與胚胎的發(fā)育和腫瘤的形成。研究表明在肺神經(jīng)內(nèi)分泌癌中14-3-3σ表達(dá)明顯減少。然而hASH1

2、在肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤高表達(dá)，而在非神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤不表達(dá)或低表達(dá)。
　　 14-3-3σ蛋白參與細(xì)胞周期G2期檢測點，它的缺失會引起的G2期檢測點缺陷，使細(xì)胞過早進(jìn)入有絲分裂而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。14-3-3σ基因在乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、皮膚癌和肝癌等多種類型腫瘤中因其啟動子CpG甲基化而沉默或低表達(dá)。研究證實在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中同樣存在14-3-3σ基因啟動子高度的超甲基化從而引起其低表達(dá)，并且14-3-3σ表達(dá)下降對神經(jīng)

3、內(nèi)分泌腫瘤形成可能是必需的。研究發(fā)現(xiàn)給予甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜胞苷（5-Aza）或組蛋白脫乙?；敢种苿┍憧赡孓D(zhuǎn)14-3-3σ的超甲基化。而hASH1是一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，可以使組蛋白去乙酰化和H3組蛋白4，9，20，27，36位賴氨酸甲基化，從而使基因沉默。同時Osada.H等研究發(fā)現(xiàn)：用RNAi方法抑制肺癌細(xì)胞系中的hASH1表達(dá)，可以引起該腫瘤細(xì)胞在G2-M期細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到治療的目的，但是其分子機制不清。本研

4、究旨在探討在肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中是否存在hASH1通過其甲基轉(zhuǎn)移酶的作用使14-3-3σ啟動子超甲基化，引起14-3-3σ沉默或低表達(dá)，造成G2-M期檢測點缺失，細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，從而產(chǎn)生腫瘤，以及14-3-3σ表達(dá)與肺腺癌臨床病理參數(shù)關(guān)系。
　　 材料與方法：
　　 一、材料
　　 47例新鮮肺腺癌標(biāo)本（來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院2008.5-2009.7），其中男性患者16例，女性患者31例；年齡34-73歲（平

5、均52.5±10）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者23例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者24例；Ⅰ+Ⅱ共19例，Ⅲ+Ⅳ共28例（國際抗癌聯(lián)盟2003年分期標(biāo)準(zhǔn)）。
　　 五種細(xì)胞系：肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞系BE-1；肺大細(xì)胞癌細(xì)胞系NCI-H460；肺腺癌細(xì)胞系LTEP-α-1，A549；肺小細(xì)胞癌細(xì)胞系NCI-H446。
　　 二、主要試劑和來源
　　 濃縮型羊抗人14-3-3σ蛋白多克隆抗體（SC-7683，Santa Cruz），
　　

6、 濃縮型兔抗人hAsh1蛋白多克隆抗體（ab-38557，abCam），
　　 Easy RT-PCR Kit（AE401，北京全式金公司），
　　 TRIzol Reagent（15595-026，invitrogen）
　　 hAsh1引物，14-3-3σ引物，β-actin 引物
　　 三、方法
　　 （一）RT-PCR
　　 取組織和對數(shù)生長期的細(xì)胞用TRIzol（invitro

7、gen）提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄條件為30℃ 10min，42℃ 40min，99℃ 5min，5℃ 5min。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5min，94℃30sec，55℃ 30sec，72℃ 40sec，72℃ 10min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5ul，2％瓊脂糖凝膠電泳，用Image J軟件進(jìn)行表達(dá)強度分析。
　　 （二）Western Blot
　　 取對數(shù)生長期的細(xì)胞提取總蛋白，超聲破碎2下，15000rpm離心15min，取上

8、清約60ul，5％濃縮膠，15％分離膠電泳，電壓濃縮膠60V，分離膠100V。40V電壓轉(zhuǎn)印約90min。在TBS/0.3％Tween-20/5％小牛血清中封閉2h。14-3-3σ和hASH1均一抗（1:500）4℃孵育過夜，二抗（1:5000）37℃孵育2h。中心實驗室發(fā)光檢測。以上實驗相同條件重復(fù)3次。
　　 四、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件，對14-3-3σ、hASH1的表達(dá)與臨床病理因素的

9、關(guān)系用X2檢驗；14-3-3σ和hASH1表達(dá)關(guān)系采用Spearman等級相關(guān)分析，其它采用t檢驗；P（0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、不同肺癌細(xì)胞系中14-3-3σ、hASH1的表達(dá)情況及兩者關(guān)系
　　 （一）RT-PCR結(jié)果
　　 在五種肺癌細(xì)胞系中14-3-3σmRNA有不同程度的表達(dá)，其中小細(xì)胞癌細(xì)胞系446最高，其次是腺癌細(xì)胞系LTE和A549（正常肺組織不表達(dá)14-3-3σ）

10、。hASH1在具有神經(jīng)內(nèi)分泌特征的肺小細(xì)胞癌細(xì)胞系446和肺大細(xì)胞癌細(xì)胞系460中高表達(dá)。但從mRNA水平來看兩者之間似乎缺乏相關(guān)性
　　 （二）Western Blot結(jié)果
　　 在五種肺癌細(xì)胞系中14-3-3σ蛋白有不同程度的表達(dá)，其中小細(xì)胞癌細(xì)胞系446最高，其次是腺癌細(xì)胞系LTE和A549（正常肺組織不表達(dá)14-3-3σ）。hASH1在具有神經(jīng)內(nèi)分泌特征的肺小細(xì)胞癌細(xì)胞系446和肺大細(xì)胞癌細(xì)胞系460中高表達(dá)。以

11、上結(jié)果與RT-PCR結(jié)果基本一致。從蛋白水平來看兩者之間同樣缺乏相關(guān)性
　　 二、肺腺癌中14-3-3σ表達(dá)高低與肺腺癌的分化、臨床病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)
　　 通過RT-PCR方法檢測了47例肺腺癌切除標(biāo)本和癌旁組織，結(jié)果顯示14-3-3σ mRNA在癌組織表達(dá)明顯高于對應(yīng)的正常肺組織，進(jìn)一步結(jié)合臨床病理參數(shù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)14-3-3σ mRNA在低分化的肺腺癌中表達(dá)明顯高于高分化肺腺癌，即與肺腺癌的分化程度呈負(fù)相關(guān)。14

12、-3-3σ mRNA高表達(dá)患者與低表達(dá)患者相比進(jìn)展更快（P=0.001），更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P=0.004），而與患者年齡（P=0.496）和性別（P=0.765）無關(guān)。這些結(jié)果表明14-3-3σ可能參與了肺腺癌的分化、演進(jìn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。
　　 結(jié)論：
　　 14-3-3σ可能與肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展、分化程度、臨床病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。并且從總體上看在5種肺癌細(xì)胞系中14-3-3σ和hASH1兩者表達(dá)之間缺乏明