唾液miRNA對食管癌預(yù)測診斷價值的探討.pdf

1、背景和目的
　　 就全球范圍而言，食管癌在各癌癥發(fā)病率中排第八位，死亡率排第六位。據(jù)統(tǒng)計，2008年，全球新發(fā)482，300例，死亡406，800例。發(fā)病率在全球各地相差16倍左右。非洲東部和北部以及東亞地區(qū)是全球高發(fā)區(qū)，而西非、中非和中美洲則是低發(fā)區(qū)。男女發(fā)病比例在3∶1到4∶1之間。在過去半個世紀(jì)，食管癌發(fā)病率在西方國家持續(xù)增加。中國是食管癌的高發(fā)國，高發(fā)區(qū)發(fā)病率可高達(dá)100/100000以上。在中國，由食管癌導(dǎo)致死亡人數(shù)占

2、了全球總死亡人數(shù)的70％以上。
　　 食管癌患者的5年總體生存率只有3％-10％。但對于癌癥分期在Ⅰ期的患者，如果接受手術(shù)治療后，5年生存率可提升至90％以上。因此食管癌的早診早治極為重要。目前，食管癌的臨床診斷主要依賴于內(nèi)鏡下的組織活檢，但由于這種方法多是在病人出現(xiàn)明顯的癥狀時檢查，且操作具有創(chuàng)傷性，費用較高，及引起病人的不適等，結(jié)果待到明確診斷時，病人多已是腫瘤晚期。因此臨床很有必要挖掘食管癌早期診斷標(biāo)志物。
　　

3、眾多研究已表明miRNAs表達(dá)失調(diào)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，miRNAs可作為腫瘤標(biāo)志物對腫瘤具有診斷有價值。多種miRNAs已被發(fā)現(xiàn)在食管癌患者的組織和血漿內(nèi)表達(dá)失調(diào)，但在唾液中表達(dá)水平及對食管癌的預(yù)測診斷價值如何，至今國內(nèi)外未見研究報道。由于唾液血運豐富，唾液被認(rèn)為是血循環(huán)的末端產(chǎn)物，很多血液中的分子物質(zhì)也見于唾液中。所以唾液被喻為“人體健康的一面鏡子(a mirror of the body's health)”，能反映機體的各種

4、疾病狀態(tài)，如癌癥、感染性疾病和心血管疾病等。近年來也有研究報道組織、血漿和唾液三者具有相似的miRNA表達(dá)譜。同時，食管癌患者主要癥狀為吞咽困難和飲食后反流甚至嘔吐，因此，患者口腔中可能殘留由食管反流入口腔的癌細(xì)胞，增加了唾液miRNAs的含量和對食管癌檢測的特異性。本研究分為篩查階段和驗證階段。在篩查階段中首先通過生物芯片技術(shù)篩選出在食管癌患者唾液中差異表達(dá)的靶miRNAs，然后在驗證階段中通過RT-PCR技術(shù)驗證靶miRNAs的表達(dá)

5、水平，探索其在食管癌中預(yù)測診斷價值。
　　 方法
　　 一、樣本量估計
　　 在篩查階段中，測得miR-144對食管癌的敏感性為85.7％數(shù)據(jù)見“數(shù)據(jù)----預(yù)實驗”文件夾。根據(jù)樣本量估計的公式n=u(α/22)P(1-P)/δ2
　　 公式中病例組n為所需例數(shù)，uα/2為檢驗水準(zhǔn)，α所對應(yīng)的雙側(cè)正態(tài)分布界值，P為敏感性的預(yù)期值，δ為允許誤差。
　　 根據(jù)本研究組獲得標(biāo)本的能力，檢驗水準(zhǔn)取α=0.

6、05（uα/2=1.96），δ取0.11。代入上述公式，得病例組所需例數(shù)n=1.962×0.857×(1-0.857)/0.152≈38.9=39。即本研究在驗證階段中，病例組需最少取39例。本研究最終取39例。按照本研究組獲得標(biāo)本的能力，設(shè)定病例組例數(shù)∶對照組例數(shù)=39∶19，本研究最終取19例。
　　 二、對象選擇
　　 隨機收集2011年7月至2012年2月廣東省人民醫(yī)院收治的46例食管癌患者唾液上清標(biāo)本。所有食管

7、癌患者均經(jīng)消化內(nèi)鏡活檢病理證實，并且無伴發(fā)其他系統(tǒng)器質(zhì)性疾病，如肝炎、糖尿病等。癌癥分期按Union for International CancerControl(UICC)第七版指南標(biāo)準(zhǔn)劃分。癌癥分期為Ⅰ至Ⅲ期者由手術(shù)病理確定癌癥分期。癌癥分期為Ⅳ期者通過遠(yuǎn)處淋巴結(jié)穿刺活檢或PET-CT檢查確定分期。無法確定分期的患者是因患者拒絕接受治療或進(jìn)一步檢查。以22例年齡、性別、種族匹配、無任何腫瘤病史的健康體檢者作為正常對照組。所有研究個

8、體均簽署知情同意書。
　　 三、唾液收集
　　 在唾液收集前，研究個體需禁食、禁飲、禁煙和禁止口腔清潔2h以上。為增加唾液收集量，采用2％檸檬酸溶液濕潤無菌棉簽棉花頭，然后將棉花頭放于研究個體舌頭一側(cè)的后側(cè)壁約5s，吐出唾液后，再將棉簽放到另一側(cè)的舌頭后側(cè)壁。如此反復(fù)收集。唾液收集量需達(dá)5ml以上，收集管使用50ml無菌無酶離心管。其中取2ml作全唾液標(biāo)本，余下3ml唾液作唾液上清標(biāo)本。同一研究個體都留有一份全唾液樣本和

9、一份唾液上清樣本。唾液上清收集條件:4℃、3000g離心15min取上層上清至1.5ml Eppendoff管，再以4℃、12000 g離心10 min后再棄沉淀取上清。標(biāo)本收集好后需2h之內(nèi)作出處理。標(biāo)本處理后均置-80℃保存。
　　 四、篩查階段的芯片檢測
　　 在食管癌組中隨機選入7例全唾液標(biāo)本和健康對照組中隨機選入3例全唾液樣本。兩組個體在性別、年齡和種族上嚴(yán)格匹配。所入選的食管癌患者中，病理類型均為鱗癌，其中包

10、括1例Ⅰ期、1例Ⅱ期、3例Ⅲ期，2例Ⅳ期。利用Agilent microarray技術(shù)，檢測樣品中923種miRNAs的表達(dá)水平。篩選出6個miRNAs是作為靶miRNAs進(jìn)行后續(xù)的驗證試驗。篩選方法如下:因為gTotalGeneSignal相對于每個miRNA的表達(dá)值，因此對于同一種miRNA，利用此值作條形圖。從條形圖高低趨勢判斷最具表達(dá)差異的miRNAs作為靶miRNAs。由此篩選出5個靶miRNAs: miR-144、miR-1

11、0b*、miR-451、miR-486-5p、miR-634。此外，多項研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在食管癌患者的病變組織和血漿中都顯著高表達(dá)，因此雖然miR-21在芯片檢測中沒有顯示出表達(dá)差異的趨勢，但也入選進(jìn)行分析。
　　 五、驗證階段
　　 對來自39例食管癌患者和19例正常對照的58份全唾液和58份唾液上清樣本采用mirVana PARIS Kit（Ambion公司）試劑盒抽提唾液中的總RNA。取1ml唾液上清或全唾液

12、，按照試劑盒的操作說明抽提總RNA，使用30μL無核酸酶水溶解RNA放-80℃保存。取2μLRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取反轉(zhuǎn)產(chǎn)物3μL作為模板，用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行RT-qPCR檢測，以miR-16為內(nèi)參。所有反應(yīng)采用3復(fù)孔。采用Biorad CFX962.1實時定量PCR儀進(jìn)行檢測。所測得的Ct值需同時滿足以下三個條件，否則該反應(yīng)需重做直至滿足仨條件為止:①3復(fù)孔Ct值之間的標(biāo)準(zhǔn)差需小于0.5

13、;②每個反應(yīng)的溶解曲線波峰需單一;③每個Ct值需＜36。miRNAs的表達(dá)量采用2-△△Ct表示[19]。即:標(biāo)本i△Ct=標(biāo)本iCtmiR-21-標(biāo)本iCtmiR-16（內(nèi)參）;標(biāo)本i△△Ct=標(biāo)本i△Ct-對照組△Ct的平均值。
　　 六、數(shù)據(jù)處理
　　 采用SPSS13.0或MedCalc12.2.1統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理。miRNA表達(dá)量和年齡兩組組間差異使用Mann-Whitney U檢驗，三組間或以上比較使用Kru

14、skal-Wallis H檢驗。性別組間差異使用卡方檢驗。對吸煙、酗酒、喝熱飲、吃熱食習(xí)慣和潮汕籍4項危險因素擬合Logistic回歸模型，采用偏最大似然估計前進(jìn)法(Forward LR)算出4項危險因素的相對危險度(Odds Ratio，OR)。各OR值顯著性檢驗采用卡方檢驗。應(yīng)用ROC(Receiver Operating Characteristic)曲線評價診斷效能。使用Spearman相關(guān)性檢驗分析同一種miRNA在全唾液和唾

15、液上清中表達(dá)水平的相關(guān)性。各靶miRNAs診斷效能的差異性比較使用MedCalc12.2.1統(tǒng)計軟件中的Delong法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 一、唾液miRNA表達(dá)譜
　　 利用Agilent microarray技術(shù)，檢測7份來自食管癌患者和3份健康人共10份全唾液樣品中923種miRNAs的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有461種miRNAs在唾液中存在表達(dá)。其中食管癌標(biāo)本發(fā)現(xiàn)452種，對照

16、樣本發(fā)現(xiàn)391種。有232種miRNAs在10份樣本中都存在表達(dá)。其中有261種miRNAs在食管癌標(biāo)本中存在表達(dá)，243種miRNAs在對照樣本中存在表達(dá)。在所檢查的miRNAs中，有25種miRNAs在食管癌組和健康對照組中存在差異性表達(dá)
　　 二、全唾液和唾液上清miRNA對食管癌的診斷價值
　　 根據(jù)microarray檢測結(jié)果，挑選出miR-10b*、miR-144、miR-21、miR-451、miR-486

17、-5p、miR-634為靶miRNAs分子。進(jìn)一步采用RT-qPCR技術(shù)驗證該6種發(fā)miRNAs的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)全唾液中的miR-10b*、miR-144、miR-451和唾液上清的miR-10b-3p、miR-144、miR-21、miR-451在患者組較對照組的表達(dá)水平明顯上調(diào)。這7個指標(biāo)在診斷食管癌的敏感性分別為:89.7％、92.3％、84.6％、79.5％、43.6％、87.2％、51.3％。特異性分別為:57.9％、47.

18、4％、57.9％、57.9％、89.5％、47.4％、84.2％。
　　 三、不同ROC曲線下面積(AUC)的對比
　　 我們使用MedCalc12.2.1統(tǒng)計軟件中的Delong法對各AUC進(jìn)行差異性比較，全唾液miR10b*、·miR-144、miR-451的AUC(P值分別為0.762、0.706、0.756)和唾液上清miR10b*、miR-144、miR-451的AUC（P值分別為0.702、0.682、0.7

19、25）差異性沒有統(tǒng)計學(xué)意義;即同一種miRNA在全唾液和唾液上清中分別對食管癌的診斷價值差異性不顯著。然后，對全唾液中對食管癌有診斷價值的3個miRNAmiR10b*、miR-144、miR-451的AUC進(jìn)行兩兩間比較。結(jié)果顯示差異也均不顯著。p值分別為0.2356(miR10b* VS miR-144)、0.8959（miR10b*VSmiR-451）、0.3248(miR-144 VSmiR-451)。最后，再對唾液上清中對食管癌

20、有診斷價值的4個miRNA miR10b*、miR-144、miR-21、miR-451的AUC進(jìn)行兩兩間比較。結(jié)果顯示差異均不顯著。p值分別為0.8251（miR10b* VSmiR-21）、0.7699(miR10b*VSmiR-451)、0.7102(miR10b* VS miR-144)、0.6079(miR-21VSmiR-451)、0.8729(miR-21 VS miR-144)、0.3529(miR-144 VSmiR-

21、451)。
　　 四、全唾液與唾液上清miRNA表達(dá)水平的相關(guān)性
　　 每個研究個體均留有全唾液和唾液上清樣本。上述結(jié)果顯示miR10b*、miR-144、miR-451在患者的全唾液和唾液上清中的表達(dá)水平均顯著上調(diào)。利用Spearman相關(guān)性檢驗分析此3種miRNA在全唾液和唾液上清中表達(dá)水平的相關(guān)性。結(jié)果顯示，3種miRNAs在全唾液和唾液上清中的表達(dá)水平均具有良好的正相關(guān)關(guān)系。p值分別為0.000（miR10b*）