非洲豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒的初步研究.pdf

1、非洲豬瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒引起的豬的一種急性傳染病，強毒株感染導致死亡率達100％，尚無理想的疫苗問世。該病尚未在我國發(fā)生，但隨著貿(mào)易往來越來越密切，該病對我國的威脅隨之加劇，因此建立對應(yīng)的實驗室診斷方法十分必要。本研究利用分子生物學方法表達非洲豬瘟病毒的pK205R蛋白，為建立快速、靈敏、特異性的血清學診斷方法奠定了基礎(chǔ)。研究取得以下結(jié)果。
　　1、非洲豬瘟病毒K205R基因的擴增

2、
　　根據(jù)已發(fā)表的K205R基因序列設(shè)計引物，以人工化學合成的含K205R基因的質(zhì)粒為模板，擴增K205R基因，將其插入pMD-18T載體中進行測序，所獲序列與已發(fā)表的ASFV-K205R(GenBank ID∶NC_001659.1)完全相同。
　　2、非洲豬瘟病毒K205R基因在大腸桿菌中的克隆表達
　　用BglⅡ、NotⅠ將含有K205R基因的重組質(zhì)粒pMD18T-K205R和載體pET-32a雙酶切后，回收、純

3、化、連接構(gòu)建成原核表達質(zhì)粒，命名為pET32a-K205R。將重組質(zhì)粒pET32a-K205R轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導其表達pK205R蛋白，運用SDS-PAGE鑒定表明pET32a-K205R在大腸桿菌中高效表達，以可溶的形式存在，表達產(chǎn)物分子量約為44.0KD。制備的兔免血清抗體效價達1∶512000。以兔免疫血清進行Western blotting，檢測顯示抗血清可與pK205R蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，說明本實

4、驗原核表達的pK205R蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可以作為檢測ASF特異抗體的抗原。利用重組蛋白所帶的6×His標簽，用HisTrap FF層析柱進行蛋白純化，獲得純度較高的重組蛋白。
　　3、建立ASFV間接ELISA抗體檢測方法
　　以純化的pK205R蛋白為包被抗原，通過對抗原最適包被濃度、血清最適稀釋度、抗原包被條件、封閉液種類、酶標二抗最適稀釋度、血清最適作用時間、酶標二抗最適作用時間、底物顯色時間的優(yōu)化，確定最適工

5、作條件。結(jié)果顯示，抗原最適包被濃度6.5μg/mL、血清最適稀釋濃度為1∶320、抗原包被條件37℃包被1h后轉(zhuǎn)4℃包被過夜、封閉液選擇1％BSA、酶標二抗的最適稀釋度為1∶4000、血清和酶標二抗最適反應(yīng)時間均為60min、底物顯色最適時間為15min。
　　4、非洲豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒組裝和質(zhì)量評價
　　利用建立的間接ELISA抗體檢測方法，研制非洲豬瘟病毒抗體檢測試劑盒，并對試劑盒的特異性、敏感性、重復(fù)

6、性、保質(zhì)期進行研究。結(jié)果表明，試劑盒在特異性方面，與標準陽性血清呈陽性反應(yīng)，而與豬瘟(HC)、豬偽狂犬(PR)、豬繁殖與呼吸綜合癥(PRRS)、副豬嗜血桿菌(Hps)、豬大腸桿菌(E.coli)和豬沙門氏菌(SB)6種疾病的陽性血清均無交叉反應(yīng);敏感性方面，當標準陽性血清稀釋到1∶5120時，檢測結(jié)果小于臨界值，建立的ELISA方法敏感性良好;重，復(fù)性方面，批內(nèi)、批間重復(fù)實驗變異系數(shù)均不超過10％。試劑盒在4℃條件下保存4個月后檢測結(jié)果