GPI錨定型CD80-CD58融合基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)、純化及其抗腫瘤作用研究.pdf

1、目的 1．將pRM10/GPI-CD80真核表達(dá)質(zhì)粒在CHO細(xì)胞中表達(dá)，經(jīng)過篩選后得到穩(wěn)定表達(dá)GPI-CDS0基因的CHO細(xì)胞。 2．提取穩(wěn)定表達(dá)GPI-CD80的CHO細(xì)胞膜蛋白，免疫親和層析法分離純化出GPI-CD80蛋白，并對純化所得到的蛋白進(jìn)行鑒定。 3．研究GPI-CD80融合蛋白的抗腫瘤作用及其機(jī)理。 方法 1．用脂質(zhì)體Lipofectamine<'TM> 2000分別將載體pRM10

2、和pRM10/GPI-CD80轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞。轉(zhuǎn)染細(xì)胞在G41 8選擇培養(yǎng)基中經(jīng)過加壓篩選，得到穩(wěn)定表達(dá)GPI-CD80的CHO細(xì)胞株后，利用免疫熒光技術(shù)對表達(dá)于CHO細(xì)胞膜的CD80分子進(jìn)行檢測；利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測在CHO細(xì)胞膜表達(dá)CD80分子的熒光陽性細(xì)胞數(shù)。 2．提取穩(wěn)定表達(dá)GPI-CD80蛋白的CHO細(xì)胞的膜蛋白后，選用鼠抗人CD80單抗，通過與溴化氫活化的Sepharose 4B藕聯(lián)制備親和層析柱，分離純化GPI-

3、CD80膜蛋白。利用Western-Blot對GPI-CD80融合蛋白進(jìn)行鑒定；PIPLC處理穩(wěn)定表達(dá)GPI-CD80的CHO細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測處理前后細(xì)胞膜上CD80蛋白的表達(dá)情況，判斷蛋白是否為GPI錨定形式；將HepG2細(xì)胞與GPI-CD80蛋白共培養(yǎng)，通過流式細(xì)胞儀檢測與GPI-CD80融合蛋白共培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)HepG2細(xì)胞表面的熒光陽性細(xì)胞率，鑒定GPI-CD80融合蛋白的錨定穩(wěn)定性。 3．將純化后的GPI-CD80

4、融合蛋白與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)后用絲裂霉素滅活，制備腫瘤疫苗，以單純絲裂霉素滅活的HepG2設(shè)為對照。將兩組疫苗與小鼠脾淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，分別在oh、24h、48h、72h，MTT法檢測腫瘤疫苗對正常小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖影響；MTT法檢測脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ的OD值；利用乳酸脫氫酶法檢測對CTL的活性影響；將HepG2細(xì)胞接種于裸鼠，第4d后再將各組腫瘤疫苗分別注射于荷瘤小鼠皮下，設(shè)PBS為空白組，絲裂霉素滅活的Hep

5、G2為陰性對照組，每3d檢測荷瘤小鼠腫瘤體積。 4．統(tǒng)計(jì)分析：統(tǒng)計(jì)分析軟件為SPSS11.5版。兩組間IL-2、IFN-γ、CTL的水平的比較采用隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的t檢驗(yàn)。不同組、不同時(shí)間點(diǎn)之間T淋巴細(xì)胞OD值、腫瘤體積的比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析。如P<0.05，則進(jìn)一步行組間、時(shí)間點(diǎn)間LSD兩兩比較(方差齊時(shí))或Tambane’s T2兩兩比較(方差不齊時(shí))。 結(jié)果 1．在CHO細(xì)胞中加入G418后，不同G4

6、18濃度條件下的CHO細(xì)胞發(fā)生了不同程度的死亡。培養(yǎng)至第14d，濃度為800μg/ml，900μg/ml，1000μg/ml的G418均可將CHO細(xì)胞殺死，而濃度為400μg/ml，500μg/ml，600μg/ml，700μg/ml的G418未能殺死全部細(xì)胞，故確定濃度800μg/ml的G418為CHO細(xì)胞在10％胎牛血清濃度下的篩選濃度。 用陽性脂質(zhì)體法將pRM10/GPI-CD80轉(zhuǎn)染至CH0細(xì)胞。轉(zhuǎn)染細(xì)胞在G418選擇培

7、養(yǎng)基中篩選后得到了穩(wěn)定表達(dá)GPI-CD80的CHO細(xì)胞株；免疫熒光化學(xué)法顯示該細(xì)胞株的膜上有強(qiáng)烈的綠色熒光，而對照組中轉(zhuǎn)染了pRM10質(zhì)粒的CHO細(xì)胞膜上未見熒光。表明GPI-CD80融合蛋白是錨定在細(xì)胞膜上的：流式細(xì)胞儀檢測篩選得到的CHO細(xì)胞，細(xì)胞膜上表達(dá)GPI-CD80的陽性細(xì)胞率和平均熒光強(qiáng)度分別高達(dá)90.02％，42，而對照組陽性率和熒光強(qiáng)度均極低：CHO細(xì)胞的陽性標(biāo)記率和平均熒光強(qiáng)度分別為0.50％，3，轉(zhuǎn)染了pRM10的C

8、HO細(xì)胞陽性標(biāo)記率和平均熒光強(qiáng)度分別為8.95％，10。 2．經(jīng)過免疫親和層析，得到純化的GPI-CD80融合蛋白。Western-Blot顯示在60KD附近有一明顯的褐色蛋白條帶出現(xiàn)；將CHO細(xì)胞、轉(zhuǎn)染TpRM10的CHO細(xì)胞、穩(wěn)定表達(dá)GPI-CD80的CHO細(xì)胞用胰酶消化后以PBS重懸，加入鼠抗人FITC-CD80抗體，流式細(xì)胞儀檢測各樣本dPCD80熒光陽性標(biāo)記細(xì)胞的陽性率及平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示CHO細(xì)胞CD80陽性標(biāo)記

9、率和平均熒光強(qiáng)度分別為0.47％，2，轉(zhuǎn)染了pRM10的CHO細(xì)胞CD80陽性標(biāo)記率和平均熒光強(qiáng)度分別為7.62％，9，穩(wěn)定表達(dá)GPI-CD80的CHO細(xì)胞CD80陽性標(biāo)記率和平均熒光強(qiáng)度分別為90.02％，42。將這些細(xì)胞用PIPLC處理4h后再進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，可見兩個(gè)對照組的CD80細(xì)胞陽性率和平均熒光強(qiáng)度幾乎沒有發(fā)生改變，而穩(wěn)定表達(dá)了GPI-CD80的CHO細(xì)胞陽性標(biāo)記率和平均熒光強(qiáng)度分別改變?yōu)?.34％，7。說明在穩(wěn)定表達(dá)G

10、PI-CD80的CHO細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白為GPI錨定蛋白。 GPI-CD80融合蛋白與HepG2細(xì)胞共同孵育30min，2h，4h，8h，16h后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面呈現(xiàn)熒光的CD80陽性細(xì)胞率分別為78.02％、75.46％、78.29％、80.40％、82.12％，各樣本進(jìn)行比較，陽性細(xì)胞數(shù)百分率變化不明顯，表明GPI-CD80融合蛋白與HepG2腫瘤細(xì)胞共孵育后，能夠錨定在腫瘤細(xì)胞膜上，而且這種錨定較穩(wěn)定。3．小鼠脾淋

11、巴細(xì)胞在經(jīng)過制備的腫瘤疫苗刺激后，OD值上升，作用24h、48h、72h時(shí)的OD值分別為0.44±0.14、0.66±0.03、0.99±0.27，與HepG2組相比差異顯著(F=63.958，P=0.000)，各時(shí)間點(diǎn)間也有顯著差異(F=51.912，P=0.003)：對各組小鼠脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-2、IFN-γ含量的檢測結(jié)果可見，腫瘤疫苗組IL-2和IFN-γ的量分別為115.94±3.57，261.96±19.06，與HepG

12、2組相比有顯著差異(P=0.000)；在對腫瘤疫苗刺激淋巴細(xì)胞后CTL活性的檢測中，腫瘤疫苗組CTL的水平明顯高于陰性對照組，有顯著差異(t=11.37，P=0.000)。 荷瘤小鼠在接受腫瘤疫苗治療后，各組間腫瘤體積大小差異顯著(F=801.801，P=0.000)，從大到小依次為：空白對照組、陰性對照組、陽性組。 結(jié)論 1．pRM10/GPI-CD80在CHO細(xì)胞中成功表達(dá)，經(jīng)過G418抗性篩選得到了穩(wěn)定表達(dá)