GPI錨定型CD80-CD58融合基因在真核細胞中的表達、純化及其抗腫瘤作用研究.pdf

1、目的 1．將pRM10/GPI-CD80真核表達質(zhì)粒在CHO細胞中表達，經(jīng)過篩選后得到穩(wěn)定表達GPI-CDS0基因的CHO細胞。 2．提取穩(wěn)定表達GPI-CD80的CHO細胞膜蛋白，免疫親和層析法分離純化出GPI-CD80蛋白，并對純化所得到的蛋白進行鑒定。 3．研究GPI-CD80融合蛋白的抗腫瘤作用及其機理。 方法 1．用脂質(zhì)體Lipofectamine<'TM> 2000分別將載體pRM10

2、和pRM10/GPI-CD80轉(zhuǎn)染至CHO細胞。轉(zhuǎn)染細胞在G41 8選擇培養(yǎng)基中經(jīng)過加壓篩選，得到穩(wěn)定表達GPI-CD80的CHO細胞株后，利用免疫熒光技術(shù)對表達于CHO細胞膜的CD80分子進行檢測；利用流式細胞技術(shù)檢測在CHO細胞膜表達CD80分子的熒光陽性細胞數(shù)。 2．提取穩(wěn)定表達GPI-CD80蛋白的CHO細胞的膜蛋白后，選用鼠抗人CD80單抗，通過與溴化氫活化的Sepharose 4B藕聯(lián)制備親和層析柱，分離純化GPI-

3、CD80膜蛋白。利用Western-Blot對GPI-CD80融合蛋白進行鑒定；PIPLC處理穩(wěn)定表達GPI-CD80的CHO細胞，流式細胞儀檢測處理前后細胞膜上CD80蛋白的表達情況，判斷蛋白是否為GPI錨定形式；將HepG2細胞與GPI-CD80蛋白共培養(yǎng)，通過流式細胞儀檢測與GPI-CD80融合蛋白共培養(yǎng)不同時間點HepG2細胞表面的熒光陽性細胞率，鑒定GPI-CD80融合蛋白的錨定穩(wěn)定性。 3．將純化后的GPI-CD80

4、融合蛋白與HepG2細胞共培養(yǎng)后用絲裂霉素滅活，制備腫瘤疫苗，以單純絲裂霉素滅活的HepG2設(shè)為對照。將兩組疫苗與小鼠脾淋巴細胞共培養(yǎng)，分別在oh、24h、48h、72h，MTT法檢測腫瘤疫苗對正常小鼠脾淋巴細胞增殖影響；MTT法檢測脾淋巴細胞分泌細胞因子IL-2、IFN-γ的OD值；利用乳酸脫氫酶法檢測對CTL的活性影響；將HepG2細胞接種于裸鼠，第4d后再將各組腫瘤疫苗分別注射于荷瘤小鼠皮下，設(shè)PBS為空白組，絲裂霉素滅活的Hep

5、G2為陰性對照組，每3d檢測荷瘤小鼠腫瘤體積。 4．統(tǒng)計分析：統(tǒng)計分析軟件為SPSS11.5版。兩組間IL-2、IFN-γ、CTL的水平的比較采用隨機設(shè)計資料的t檢驗。不同組、不同時間點之間T淋巴細胞OD值、腫瘤體積的比較采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析。如P<0.05，則進一步行組間、時間點間LSD兩兩比較(方差齊時)或Tambane’s T2兩兩比較(方差不齊時)。 結(jié)果 1．在CHO細胞中加入G418后，不同G4

6、18濃度條件下的CHO細胞發(fā)生了不同程度的死亡。培養(yǎng)至第14d，濃度為800μg/ml，900μg/ml，1000μg/ml的G418均可將CHO細胞殺死，而濃度為400μg/ml，500μg/ml，600μg/ml，700μg/ml的G418未能殺死全部細胞，故確定濃度800μg/ml的G418為CHO細胞在10％胎牛血清濃度下的篩選濃度。 用陽性脂質(zhì)體法將pRM10/GPI-CD80轉(zhuǎn)染至CH0細胞。轉(zhuǎn)染細胞在G418選擇培

7、養(yǎng)基中篩選后得到了穩(wěn)定表達GPI-CD80的CHO細胞株；免疫熒光化學法顯示該細胞株的膜上有強烈的綠色熒光，而對照組中轉(zhuǎn)染了pRM10質(zhì)粒的CHO細胞膜上未見熒光。表明GPI-CD80融合蛋白是錨定在細胞膜上的：流式細胞儀檢測篩選得到的CHO細胞，細胞膜上表達GPI-CD80的陽性細胞率和平均熒光強度分別高達90.02％，42，而對照組陽性率和熒光強度均極低：CHO細胞的陽性標記率和平均熒光強度分別為0.50％，3，轉(zhuǎn)染了pRM10的C

8、HO細胞陽性標記率和平均熒光強度分別為8.95％，10。 2．經(jīng)過免疫親和層析，得到純化的GPI-CD80融合蛋白。Western-Blot顯示在60KD附近有一明顯的褐色蛋白條帶出現(xiàn)；將CHO細胞、轉(zhuǎn)染TpRM10的CHO細胞、穩(wěn)定表達GPI-CD80的CHO細胞用胰酶消化后以PBS重懸，加入鼠抗人FITC-CD80抗體，流式細胞儀檢測各樣本dPCD80熒光陽性標記細胞的陽性率及平均熒光強度。結(jié)果顯示CHO細胞CD80陽性標記

9、率和平均熒光強度分別為0.47％，2，轉(zhuǎn)染了pRM10的CHO細胞CD80陽性標記率和平均熒光強度分別為7.62％，9，穩(wěn)定表達GPI-CD80的CHO細胞CD80陽性標記率和平均熒光強度分別為90.02％，42。將這些細胞用PIPLC處理4h后再進行流式細胞儀檢測，可見兩個對照組的CD80細胞陽性率和平均熒光強度幾乎沒有發(fā)生改變，而穩(wěn)定表達了GPI-CD80的CHO細胞陽性標記率和平均熒光強度分別改變?yōu)?.34％，7。說明在穩(wěn)定表達G

10、PI-CD80的CHO細胞表面表達的蛋白為GPI錨定蛋白。 GPI-CD80融合蛋白與HepG2細胞共同孵育30min，2h，4h，8h，16h后，流式細胞儀檢測細胞表面呈現(xiàn)熒光的CD80陽性細胞率分別為78.02％、75.46％、78.29％、80.40％、82.12％，各樣本進行比較，陽性細胞數(shù)百分率變化不明顯，表明GPI-CD80融合蛋白與HepG2腫瘤細胞共孵育后，能夠錨定在腫瘤細胞膜上，而且這種錨定較穩(wěn)定。3．小鼠脾淋

11、巴細胞在經(jīng)過制備的腫瘤疫苗刺激后，OD值上升，作用24h、48h、72h時的OD值分別為0.44±0.14、0.66±0.03、0.99±0.27，與HepG2組相比差異顯著(F=63.958，P=0.000)，各時間點間也有顯著差異(F=51.912，P=0.003)：對各組小鼠脾淋巴細胞培養(yǎng)液中IL-2、IFN-γ含量的檢測結(jié)果可見，腫瘤疫苗組IL-2和IFN-γ的量分別為115.94±3.57，261.96±19.06，與HepG

12、2組相比有顯著差異(P=0.000)；在對腫瘤疫苗刺激淋巴細胞后CTL活性的檢測中，腫瘤疫苗組CTL的水平明顯高于陰性對照組，有顯著差異(t=11.37，P=0.000)。 荷瘤小鼠在接受腫瘤疫苗治療后，各組間腫瘤體積大小差異顯著(F=801.801，P=0.000)，從大到小依次為：空白對照組、陰性對照組、陽性組。 結(jié)論 1．pRM10/GPI-CD80在CHO細胞中成功表達，經(jīng)過G418抗性篩選得到了穩(wěn)定表達