TIPE2通過IRF4調(diào)控胃癌細胞增殖機制的研究.pdf

1、目的:研究TLR信號通路負性調(diào)節(jié)因子TIPE2在胃炎到胃癌發(fā)生發(fā)展中的功能，并研究TIPE2通過誘導調(diào)控IRF4抑制胃上皮細胞增殖的分子機制，從而為胃癌疾病的發(fā)生發(fā)展提供了新線索。
　　方法:1.組織水平上，以免疫組織化學方法檢查不同程度胃炎組織，胃癌組織中TIPE2蛋白表達情況。同時提取組織的RNA，通過qRT-PCR方法檢測mRNA水平上TIPE2的表達;提取TIPE2基因敲除小鼠肝、腎、小腸、心臟、胃等器官組織的RNA，利用

2、Western blot方法檢測蛋白水平上IRF4表達，同時通過qRT-PCR方法檢測mRNA水平上IRF4的表達情況。
　　2.細胞水平上，通過轉染人TIPE2高表達的質粒pRK5-tipe2進入胃上皮細胞系，使得細胞內(nèi)過表達TIPE2，檢測TIPE2在胃癌上皮細胞增殖中的作用:
　　(1)質粒轉染:將人TIPE2高表達質粒pRK5-tipe2及其對照質粒pRK5-mock轉染胃上皮細胞系AGS，分別于48小時、72小時后

3、收集細胞，提取RNA和蛋白質。通過Western blot和qRT-PCR分別在蛋白水平和mRNA水平檢測TIPE2的表達，并評估質粒轉染的效率。
　　(2)細胞增殖能力檢測:以2u g、4ug、8ug的濃度梯度轉染TIPE2表達質粒pRK5-tipe2以及對照質粒pRK5-mock進入AGS細胞，于48小時進行細胞計數(shù)，以每孔300個細胞的比例加入六孔板中，培養(yǎng)至形成肉眼可見的克隆群落，比較兩組的差異。
　　(3)研究TI

4、PE2對細胞周期的影響:TIPE2表達質粒pRK5-tipe2和pRK5-mock對照質粒進入AGS細胞24小時、48小時、72小時，以流式細胞術分析這些細胞所處周期的變化。
　　(4)生物芯片分析TIPE2抑制增殖可能的分子機制:AGS細胞在轉染TIPE2高表達質粒后，進行表達譜生物芯片分析，并以Western blot和qRT-PCR方法對顯著變化的靶基因機器通路相關分子在蛋白和mRNA水平進行驗證。
　　(5)小干擾R

5、NA轉染:轉染TIPE2表達質粒pRK5-tipe2和pRK5-mock對照質粒進入AGS細胞，24小時后部分AGS細胞分別轉染小干擾IRF4 RNA，48小時后，收集蛋白及提取RNA，并以Western blot和qRT-PCR方法檢測IRF4蛋白和mRNA水平，同時也檢測TIPE2蛋白與mRNA水平驗證基因敲減效率。
　　(6)通路抑制劑:對AGS細胞系分別加入不同信號通路特有的抑制劑，72小時后收集蛋白質檢測蛋白水平IRF4

6、的變化，判斷TIPE2用以調(diào)節(jié)IRF4的信號通路。
　　結果:1.免疫組化結果顯示TIPE2在胃部的正常組織高表達，但在胃部慢性炎癥組織中表達降低而且與炎癥的嚴重程度呈負相關，在胃癌組織中無表達;并且qRT-PCR在mRNA水平驗證了免疫組化的結果，證明在胃部疾病發(fā)生發(fā)展時TIPE2表達發(fā)生變化并且隨疾病的進展程度呈現(xiàn)負相關。
　　2.胃上皮細胞轉染TIPE2表達質粒后，在蛋白質水平上TIPE2表達量明顯升高;同時能夠檢測到

7、細胞克隆形成能力明顯受到抑制。
　　3.流式細胞術結果顯示TIPE2過表達能夠抑制S期細胞的比例，使細胞停留在G1期，表明TIPE2通過抑制細胞進入S期而抑制上皮細胞增殖。
　　4.生物基因芯片以及蛋白質分析結果表明，IFR4表達水平與TIPE2轉染呈現(xiàn)劑量依賴性;敲除TIPE2基因的小鼠器官組織內(nèi)IRF4表達下調(diào)。
　　5.通過轉染IRF4小干擾RNA進一步驗證TIPE2是通過調(diào)控IRF4表達來發(fā)揮抑制細胞增殖的作用