轉(zhuǎn)錄因子C-EBPβ參與HCMV UL111A基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究.pdf

1、目的:本研究通過(guò)檢測(cè)HCMV潛伏感染與激活感染THP-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ的表達(dá)，分析C/EBPβ與HCMVUL111A基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合率、UL111A基因啟動(dòng)子結(jié)合區(qū)組蛋白修飾和DNA甲基化情況，探討轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ參與HCMV UL111A基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，為進(jìn)一步研究HCMV感染的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.建立HCMV潛伏與激活感染THP-1細(xì)胞模型HCMV AD169株(MOI=5)

2、感染THP-1細(xì)胞，37℃C、5％ CO2環(huán)境中培養(yǎng)10d。熒光定量PCR測(cè)定細(xì)胞內(nèi)HCMV-DNA拷貝數(shù);RT-PCR檢測(cè)HCMV UL123、UL83和LUNA mRNA的表達(dá)，判斷HCMV是否為潛伏感染狀態(tài)。
　　HCMV潛伏感染THP-1細(xì)胞后，加入佛波酯（PMA，終濃度為100 ng/μl），37℃、5％ CO2環(huán)境中培養(yǎng)10d。熒光定量PCR方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)HCMV-DNA的拷貝數(shù);RT-PCR檢測(cè)HCMV UL123、

3、UL83和LUNA mRNA的表達(dá)，判斷經(jīng)PMA刺激誘導(dǎo)后HCMV是否為激活感染狀態(tài)。
　　2.轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ與HCMV UL111A基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合實(shí)驗(yàn)熒光定量PCR測(cè)定HCMV潛伏與激活感染時(shí)cmvIL-10剪接體的轉(zhuǎn)錄表達(dá);染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)分析HCMV潛伏與激活感染時(shí)C/EBPβ與UL111A基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合情況;Western blot測(cè)定HCM

4、V潛伏與激活感染時(shí)細(xì)胞核內(nèi)C/EBPβ的表達(dá)。
　　3.HCMV UL111A基因啟動(dòng)子區(qū)表觀遺傳學(xué)修飾實(shí)驗(yàn)采用ChIP技術(shù)分析HCMV潛伏與激活感染時(shí)UL111A基因啟動(dòng)子C/EBPβ結(jié)合區(qū)組蛋白與抗組蛋白H3-K9乙?；贵w、二甲基化抗體的結(jié)合情況。
　　采用亞硫酸氫鹽測(cè)序法(Bisulfite Sequencing PCR, BSP)分析HCMV潛伏與激活感染時(shí)UL111A基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)。
　　結(jié)果

5、:
　　1.HCMV潛伏與激活感染THP-1細(xì)胞模型的建立HCMV AD169株感染THP-1細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)HCMV-DNA拷貝數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加基本不變。UL123 mRNA在感染后第1天即有表達(dá)，第5天達(dá)到高峰，隨后逐漸下降直至消失;UL83 mRNA在感染過(guò)程中未見(jiàn)表達(dá);LUNA mRNA在感染過(guò)程中持續(xù)表達(dá)，提示HCMV在THP-1細(xì)胞中處于潛伏狀態(tài)。
　　PMA刺激誘導(dǎo)HCMV潛伏感染的THP-1細(xì)胞分化后，細(xì)胞

6、內(nèi)HCMV-DNA拷貝數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而升高;UL83 mRNA在PMA刺激后第5天開(kāi)始持續(xù)表達(dá)。UL123 mRNA、LUNA mRNA在感染過(guò)程中均持續(xù)表達(dá)，提示經(jīng)PMA刺激誘導(dǎo)后HCMV在分化的THP-1細(xì)胞中處于激活狀態(tài)。
　　2.轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ與HCMV UL111A基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合分析HCMV潛伏與激活感染THP-1細(xì)胞4d后，熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，cmvIL-10剪接體在HCMV潛伏感染中未轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而H

7、CMV激活感染中可見(jiàn)轉(zhuǎn)錄表達(dá);ChIP分析顯示，HCMV潛伏感染時(shí)轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ與UL111A基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合率較HCMV激活感染低(P＜0.05);Western blot檢測(cè)顯示，HCMV激活感染細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ表達(dá)高于潛伏感染。
　　3.HCMV UL111A基因啟動(dòng)子區(qū)表觀遺傳學(xué)修飾結(jié)果ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在HCMV潛伏與激活感染過(guò)程中，HCMVUL111A基因啟動(dòng)子C/EBPβ結(jié)合區(qū)均未見(jiàn)組蛋白H3

8、-K9乙酰化和甲基化修飾。
　　BSP分析發(fā)現(xiàn)，在HCMV潛伏與激活感染組中均未見(jiàn)C/EBPβ結(jié)合位點(diǎn)存在DNA甲基化，而HCMV潛伏感染時(shí)UL111A基因啟動(dòng)子區(qū)DNA總甲基化率高于激活感染(X2=5.18，P＜0.05)。
　　結(jié)論:本研究結(jié)果表明，HCMV激活感染時(shí)表達(dá)cmvIL-10剪接體，潛伏感染未見(jiàn)表達(dá);HCMV激活感染時(shí)細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ的表達(dá)高于潛伏感染;HCMV激活感染時(shí)轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ與UL