CB2受體激動(dòng)劑預(yù)處理通過影響小膠質(zhì)細(xì)胞EAAT產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用.pdf

1、腦缺血/再灌注損傷嚴(yán)重威脅著人們的生命和生存質(zhì)量,如何有效地預(yù)防和減輕缺血性腦損傷已成為目前醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)之一。谷氨酸是一種重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),也是導(dǎo)致腦損傷最主要的興奮性氨基酸。在生理狀態(tài)下,神經(jīng)細(xì)胞外的谷氨酸濃度處在一種動(dòng)態(tài)平衡中;病理情況下,由于谷氨酸產(chǎn)生過多或代謝異常,在突觸間隙大量蓄積,造成神經(jīng)細(xì)胞的損傷。位于膠質(zhì)細(xì)胞表面的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體將谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)至膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi),由谷氨酰胺合成酶代謝為無神經(jīng)毒性的谷氨酰胺。
　　因此,調(diào)

2、節(jié)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體功能、維持神經(jīng)細(xì)胞外谷氨酸濃度正常水平,對(duì)預(yù)防和減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷具有重要作用。我們實(shí)驗(yàn)室率先報(bào)道電針刺激大鼠“百會(huì)穴”,可模擬缺血預(yù)處理產(chǎn)生“腦缺血耐受”效應(yīng),從而提出“電針預(yù)處理”的概念;同時(shí)我們探索發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理腦缺血耐受效應(yīng)的穴位特異性(百會(huì)穴)和最佳刺激參數(shù)(2/15Hz,1mA,30min/d,5d)。并進(jìn)一步研究證實(shí)電針預(yù)處理可增加腦組織內(nèi)源性大麻素配體(2-AG和AEA)合成,增強(qiáng)神經(jīng)元大麻素受體(CB1)表

3、達(dá),上調(diào)ERK1/2磷酸化水平,但激活內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)減輕谷氨酸對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷的機(jī)制尚不清楚,有待進(jìn)一步研究。
　　因此,我們采用細(xì)胞培養(yǎng)方法,觀察CB2激動(dòng)劑預(yù)處理是否通過影響小膠質(zhì)細(xì)胞興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(EAAT)對(duì)抗谷氨酸毒性,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。第一部分CB2受體激動(dòng)劑預(yù)處理對(duì)谷氨酸所致小膠質(zhì)細(xì)胞損傷的保護(hù)。
　　作用方法：
　　1.研究不同濃度谷氨酸對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響將小膠質(zhì)細(xì)胞分6組,分別用含0mmol

4、/L谷氨酸(Control組)和含1、3、5、10、20mmol/L5個(gè)不同濃度谷氨酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞24h,應(yīng)用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率。
　　2.研究不同濃度CB2受體激動(dòng)劑預(yù)處理對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響將小膠質(zhì)細(xì)胞分為6組,分別為谷氨酸組和濃度為0.5、1、2、3和5μmol/L CB2受體激動(dòng)劑AM1241預(yù)處理組,預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞2h后用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)2h,再更換含10mmol/L谷氨酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后,采用

5、MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率。
　　3.觀察CB2受體激動(dòng)劑預(yù)處理對(duì)谷氨酸所致小膠質(zhì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用小膠質(zhì)細(xì)胞被分為6組,分別為Control組、AM1241組、AM630組、谷氨酸(Glu)組、AM1241+Glu組和AM1241+AM630+Glu組,其中,Control組正常培養(yǎng)28h;AM1241組和AM630組小膠質(zhì)細(xì)胞分別為2μmol/LCB2激動(dòng)劑AM1241或6μmol/L CB2拮抗劑AM630預(yù)處理2h后,更換

6、培養(yǎng)基正常培養(yǎng)26h;而AM1241+Glu組和AM1241+AM630+Glu組細(xì)胞分別用含2μmol/LAM1241和同時(shí)含2μmol/LAM1241與6μmol/LAM630的培養(yǎng)基培養(yǎng)2h后,換用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)2h,再更換含10mmol/L Glu的培養(yǎng)基損傷24h,最后,各組分別采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活情況、乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH漏出量并使用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。
　　結(jié)果：

7、>　　1.不同濃度谷氨酸對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響與Control組相比,1、3、5、10、20mmol/L谷氨酸損傷均可顯著降低小膠質(zhì)細(xì)胞存活率(P＜0.05),其中10mmol/L谷氨酸損傷可使細(xì)胞存活率下降至Control組的50％左右。
　　2.不同濃度CB2受體激動(dòng)劑預(yù)處理對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞存活率的影響與谷氨酸組相比,1、2、3、5μmol/L CB2受體激動(dòng)劑AM1241預(yù)處理均可使小膠質(zhì)細(xì)胞存活率升高(P＜0.05),其中2

8、μmol/L AM1241預(yù)處理保護(hù)作用最強(qiáng)。
　　3.CB2受體激動(dòng)劑預(yù)處理對(duì)谷氨酸所致小膠質(zhì)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用；
　　3.1細(xì)胞存活率與Glu組相比,AM1241+Glu組細(xì)胞存活率明顯上升(P＜0.05),而與AM1241+Glu組相比,AM1241+AM630+Glu組細(xì)胞存活率下降(P＜0.05)。
　　3.2乳酸脫氫酶(LDH)與Glu組相比,AM1241+Glu組細(xì)胞LDH漏出量明顯下降(P＜0.05)

9、,而與AM1241+Glu組相比,AM1241+AM630+Glu組細(xì)胞LDH漏出量上升(P＜0.05)。
　　3.3細(xì)胞形態(tài)Glu組大量細(xì)胞破壞碎裂,細(xì)胞輪廓增強(qiáng),胞體粗糙,偽足消失;AM1241+Glu組細(xì)胞與Glu組相比破壞較輕,胞體略有增大,偽足消失較Glu組減少。而AM1241+AM630+Glu組細(xì)胞形態(tài)與Glu組相比無明顯差異。第二部分小膠質(zhì)細(xì)胞EAAT在CB2受體激動(dòng)劑預(yù)處理減輕谷氨酸所致神經(jīng)元損傷中的作用方法1觀

10、察CB2受體激動(dòng)劑預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)谷氨酸所致神經(jīng)元損傷的影響小膠質(zhì)細(xì)胞被分為7組,分別為Control組、AM1241組、AM630組、Glu組、AM1241+Glu組、AM630+Glu組和AM1241+AM630+Glu組,其中,Control組正常培養(yǎng)30h;AM1241組和AM630組小膠質(zhì)細(xì)胞分別為2μmol/L CB2激動(dòng)劑AM1241或6μmol/L CB2拮抗劑AM630預(yù)處理4h后,更換培養(yǎng)基正常培養(yǎng)26h;而AM1

11、241+Glu組和AM1241+AM630+Glu組細(xì)胞分別用含2μmol/LAM1241或6μmol/LAM630和同時(shí)含2μmol/LAM1241與6μmol/L AM630的培養(yǎng)基培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞4h后,換用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)2h,再更換含10mmol/L Glu的培養(yǎng)基損傷24h,最后,吸取各組小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞24h,采用MTT法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞存活情況。
　　2.觀察CB2激動(dòng)劑預(yù)處理對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞EAAT2表達(dá)量的影

12、響小膠質(zhì)細(xì)胞被分為4組,分別為Glu組、AM1241組、AM630組和TBOA組,其中,Glu組正常培養(yǎng)6h,換用含10mmol/L Glu的培養(yǎng)基損傷24h;AM1241組、AM630組和TBOA組小膠質(zhì)細(xì)胞分別為2μmol/L AM1241、2μmol/L AM1241和6μmol/L AM630、同時(shí)含2μmol/L AM1241和100μmol/LTBOA的培養(yǎng)基預(yù)處理4h后,更換培養(yǎng)基正常培養(yǎng)2h,再更換含10mmol/LGl

13、u的培養(yǎng)基損傷24h,最后進(jìn)行Western blot檢測(cè)和免疫熒光染色。
　　3.研究CB2受體激動(dòng)劑預(yù)處理保護(hù)作用是否與小膠質(zhì)細(xì)胞的EAAT相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞被分為7組,分別為Control組、AM1241組、TBOA組、Glu組、AM1241+Glu組、TBOA+Glu組和AM1241+TBOA+Glu組,其中,Control組正常培養(yǎng)30h;AM1241組和TBOA組小膠質(zhì)細(xì)胞分別為2μmol/LCB2激動(dòng)劑AM1241或10

14、0μmol/L EAAT拮抗劑TBOA預(yù)處理4h后,更換培養(yǎng)基正常培養(yǎng)26h;而AM1241+Glu組和AM1241+TBOA+Glu組細(xì)胞分別用含2μmol/LAM1241或100μmol/LTBOA和同時(shí)含2μmol/LAM1241與100μmol/L TBOA的培養(yǎng)基培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞4h后,換用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)2h,再更換含10mmol/L Glu的培養(yǎng)基損傷24h,最后,吸取各組小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞24h,采用MTT法檢測(cè)

15、神經(jīng)細(xì)胞存活情況。
　　結(jié)果：
　　1.CB2受體激動(dòng)劑AM1241預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)谷氨酸神經(jīng)元損傷的影響與Glu組相比,AM1241+Glu組神經(jīng)細(xì)胞存活率明顯上升(P＜0.05),而與AM1241+Glu組相比,AM1241+AM630+Glu組神經(jīng)細(xì)胞存活率下降(P＜0.05)。
　　2.CB2激動(dòng)劑預(yù)處理對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞EAAT2表達(dá)量的影響；
　　2.1Western blot檢測(cè)CB2受體激動(dòng)劑處理增加

16、了EAAT2蛋白的表達(dá)量。Western blot結(jié)果顯示,與Glu組相比,AM1241組EAAT2蛋白的表達(dá)顯著增高(P＜0.05),與AM1241組相比, AM630組和TBOA組EAAT2蛋白的表達(dá)明顯降低(P＜0.05)。
　　2.2免疫熒光染色免疫熒光染色照片顯示,與Glu組相比,AM1241組紅色熒光(EAAT2)增強(qiáng);而與AM1241組相比,AM630組和TBOA組紅色熒光明顯減弱。
　　3.CB2受體激動(dòng)劑預(yù)

17、處理保護(hù)作用與小膠質(zhì)細(xì)胞的EAAT相關(guān)與Glu組相比,AM1241+Glu組神經(jīng)細(xì)胞存活率明顯上升(P＜0.05),而與AM1241+Glu組相比,AM1241+TBOA+Glu組神經(jīng)細(xì)胞存活率下降(P＜0.05)。
　　小結(jié)：
　　1.CB2受體激動(dòng)劑AM1241預(yù)處理可以減輕谷氨酸所致小膠質(zhì)細(xì)胞的損傷, CB2受體拮抗劑AM630可以使其預(yù)處理保護(hù)作用消失,提示激動(dòng)小膠質(zhì)細(xì)胞CB2受體可使谷氨酸所致細(xì)胞損傷減輕。