G蛋白抑制性多肽GCIP的優(yōu)化與活性研究.pdf

1、心肌肥大是高血壓、冠心病、瓣膜病及先天性心臟病等多種心血管疾病的常見(jiàn)并發(fā)癥，是心肌細(xì)胞對(duì)多種病理刺激的一種共同反應(yīng)。初期的心肌肥大有一定的代償意義，但最終會(huì)造成心肌耗氧量增加，冠脈血流儲(chǔ)備減少，心肌缺血加重，誘發(fā)心衰、心律失常、擴(kuò)張性心肌病，甚至猝死。近年來(lái)，心肌肥大作為一種引起心血管疾病發(fā)病率和死亡率顯著升高的獨(dú)立危險(xiǎn)因素和重要原因，引起了人們的廣泛重視和高度關(guān)注，逆轉(zhuǎn)心肌肥大已成為當(dāng)前治療高血壓及慢性充血性心力衰竭的重要目標(biāo)之一。盡

2、管ACEI、AngⅡ受體Ⅰ阻斷劑和鈣拮抗劑等降壓藥物有一定程度上的抗心肌肥大作用，但引起心肌肥大的因素眾多，而這些藥物靶點(diǎn)單一，僅作用于其中的某一因素或環(huán)節(jié)，而且在降低血壓的同時(shí)，會(huì)引起其他內(nèi)源性血管活性物質(zhì)代償性增多，療效有限。 在多種因素誘發(fā)心肌肥大的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，G蛋白處于樞紐地位，針對(duì)G蛋白設(shè)計(jì)特異性阻止心肌肥大發(fā)生發(fā)展的藥物可能具有更強(qiáng)的作用。本室既往研究發(fā)現(xiàn)G蛋白抑制性多肽GCIP可顯著抑制去甲腎上腺素誘導(dǎo)的心

3、肌細(xì)胞肥大反應(yīng)。為進(jìn)一步提高療效，方便合成，降低成本，本課題在GCIP的研究基礎(chǔ)上，運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)了系列優(yōu)化多肽，選擇評(píng)估較優(yōu)的兩種進(jìn)行固相合成，并分別進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)、整體動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，觀察其抗心肌肥大作用，并對(duì)其可能分子機(jī)制進(jìn)行探討。 方法：利用ProtScale、ProtParam等生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)GCIP的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)，根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果、G蛋白家族的功能結(jié)構(gòu)域和黃金分割法進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)；優(yōu)篩

4、出的多肽采用固相方法合成。心肌肥大體外模型分別采用去甲腎上腺素和血管緊張素Ⅱ刺激培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞方法；整體模型分別選用大鼠和小鼠，采用去甲腎上腺素腹腔注射和腹主動(dòng)脈縮窄法。培養(yǎng)心肌細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量與蛋白質(zhì)合成速率分別采用Lowry法和3H-亮氨酸摻入法測(cè)定；細(xì)胞[Ca2+]i采用Fluo-3/AM負(fù)載、激光共聚焦顯微鏡掃描法測(cè)定；c-Fos和p-ERK1/2蛋白表達(dá)量測(cè)定采用免疫組化、免疫細(xì)胞化學(xué)和斑點(diǎn)免疫印跡法；c-FosmRNA和c

5、-junmRNA表達(dá)量測(cè)定采用RT-PCR法。 結(jié)果：1.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示GCIP第15位及第30位附近各有一親水性峰，分子可形成三個(gè)疏水簇區(qū)域和兩個(gè)親水區(qū)域，分別在第15位和第30位殘基周圍；第14～18位之間為溶劑可及性最大區(qū)域；第15～18位及30～32位附近區(qū)域柔韌性較大；第36～40位之間為殘基隱藏性最好區(qū)域；第28～32位殘基為相對(duì)可突變性最大的區(qū)域；在第14～17位之間區(qū)域形成β轉(zhuǎn)角可能性最大，25～28位之間也

6、可能形成β轉(zhuǎn)角。GOR二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示在GCIP的兩端各有一段α螺旋，15～17、24～28位之間可能形成β轉(zhuǎn)角。16～19位可能為蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，28～31位可能為酪蛋白(casein)激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明GCIP的空間結(jié)構(gòu)兩端共有兩段α螺旋，中間有一段β折疊，由兩個(gè)β-轉(zhuǎn)角相連接。 2.首先設(shè)計(jì)了13種候選多肽，經(jīng)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析，確定選擇GCIP-31和GCIP-27，進(jìn)行人工合成和藥理作用評(píng)價(jià)。固相合

7、成的兩種肽純度分別為99.64％和97.40％，分子量與理論計(jì)算值相符。 3.GCIP-27進(jìn)一步優(yōu)化預(yù)測(cè)顯示，從N端逐個(gè)截短及首位突變?cè)O(shè)計(jì)的36種多肽綜合性質(zhì)均無(wú)明顯改善。 4.100μg/L～10mg/L的GCIP-27可明顯減小體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞直徑；10μg/L～10mg/L的GCIP-27能夠顯著降低NE刺激的肥大心肌細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量和3H-Leu摻入率；3～30μg/L的GCIP-27可顯著減少AngⅡ刺激心肌

8、細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量和3H-Leu摻入率。GCIP-31僅在10mg/L時(shí)具有降低心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)含量作用，其余劑量組對(duì)細(xì)胞直徑、蛋白質(zhì)含量與合成速率均無(wú)明顯影響。 5.NE可明顯誘導(dǎo)小鼠和大鼠出現(xiàn)心肌肥大，GCIP-2710μg/kg～100μg/kg(ip，bid)能明顯抑制小鼠心肌肥大的發(fā)生，降低左心室指數(shù)；5.0μg/kg～45μg/kg(ip，bid)能明顯阻止大鼠發(fā)生心肌肥大，改善左心室指數(shù)。 6.7.5μg/kg

9、和15μg/kgGCIP-27能顯著降低主動(dòng)脈縮窄大鼠的心臟指數(shù)和左心室指數(shù)。 7.1，3，10nmol/L的GCIP-27可顯著降低AngⅡ或NE刺激的培養(yǎng)心肌細(xì)胞Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度。預(yù)先加入GCIP-27可拮抗AngⅡ或NE刺激所引起的[Ca2+]i升高。 8.GCIP-27能夠明顯降低NE誘導(dǎo)的小鼠和大鼠肥大心肌組織中c-Fos表達(dá)量和p-ERK1/2表達(dá)量。 9.1～10nmol/L的GCIP-27能夠

10、明顯降低AngⅡ誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)大鼠肥大心肌細(xì)胞中c-Fos表達(dá)量和p-ERK1/2表達(dá)量。 10.腹腔注射NE后30min，大鼠心肌組織中c-fosmRNA和c-junmRNA表達(dá)明顯增加，GCIP-27具有明顯抑制其升高作用。 11.25mg/LGCIP-27對(duì)3T3細(xì)胞和大鼠心肌成纖維細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。 12.小鼠對(duì)GCIP-27耐量大于50mg/kg(ip)。 結(jié)論：1.GCIP-27和GCIP

11、-31是綜合評(píng)價(jià)性質(zhì)較優(yōu)的候選多肽。 2.GCIP-27可明顯減小體外培養(yǎng)的肥大心肌細(xì)胞直徑，降低細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量及蛋白質(zhì)合成速率；GCIP-31則無(wú)效。 3.GCIP-27具有明顯的抑制大鼠和小鼠發(fā)生心肌肥大的作用。 4.GCIP-27的抗心肌肥大作用機(jī)制與其降低心肌細(xì)胞[Ca2+]i，抑制p-ERK1/2表達(dá)，降低原癌基因c-fos和c-jun表達(dá)有關(guān)。 5.GCIP-27(25mg/L)不影響體外培