棉籽抗氧化多肽和ACE抑制多肽的研究.pdf

1、棉籽蛋白氨基酸組成齊全,比例合理,營養(yǎng)價(jià)值接近豆類蛋白質(zhì),是一種十分重要的植物蛋白質(zhì)資源。但目前對(duì)棉籽蛋白的食用功能及棉籽蛋白活性肽的生物活性方面的深入研究尚未見到較詳細(xì)的報(bào)導(dǎo)。本課題以脫酚無毒棉籽餅粕為原料,提取棉籽蛋白,加入生物酶進(jìn)行酶解,對(duì)水解物的抗氧化能力和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制活性進(jìn)行分析,利用超濾、凝膠色譜、反相高效液相色譜、等方法進(jìn)行產(chǎn)物分離純化,并用質(zhì)譜對(duì)得到的活性肽進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。本論文系統(tǒng)研究了酶解工藝的各主

2、要參數(shù)、產(chǎn)物的抗氧化活性和ACE抑制活性、抗氧化肽和.ACE抑制肽的分離純化和結(jié)構(gòu)表征,為開發(fā)功能性產(chǎn)品提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。主要結(jié)果如下:
　　 1.利用堿法提取棉籽蛋白,正交法優(yōu)化提取條件。采用SDS-PAGE測(cè)定棉籽蛋白的亞基成分,結(jié)果顯示減法提取的蛋白組成較簡(jiǎn)單。氨基酸分析結(jié)果顯示棉籽蛋白氨基酸組成獨(dú)特,平衡良好。同時(shí)棉籽蛋白具有較好的保水性和吸油性,以及良好的乳化性和乳化穩(wěn)定性,適合應(yīng)用于食品中。
　　 2.

3、以棉籽蛋白為底物,分別用商品酶Alcalase堿性蛋白酶、Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶對(duì)其進(jìn)行水解,測(cè)定了各酶解物的水解度和抗氧化能力。結(jié)果表明Neutrase中性蛋白酶水解物的抗氧化能力最強(qiáng)。在Neutrase中性蛋白酶水解棉籽蛋白單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)進(jìn)行了試驗(yàn)優(yōu)化,得到最優(yōu)的酶解條件為:溫度39.5℃、水解pH為7.5、水解時(shí)間5.5h,在此水解條件下,水

4、解度可達(dá)到38.09％。
　　 3.利用Sephadex G-25凝膠色譜將棉籽蛋白Neutrase中性蛋白酶水解物(CPH)分成四個(gè)組分Fra.Ⅰ～Ⅳ,通過抗氧化活性分析,發(fā)現(xiàn)Fra.Ⅲ具有最強(qiáng)的抗氧化活性。采用半制備RP-HPLC將Fra.Ⅲ分成8個(gè)組分,以DPPH清除率為指標(biāo)篩選出具有較強(qiáng)抗氧化活性的組分Fra.Ⅲ-5,經(jīng)RP-HPLC鑒定為單一峰；采用MALDI-TOF-TOF二級(jí)質(zhì)譜,鑒定抗氧化活性肽Fra.Ⅲ-5的相

5、對(duì)分子量為857.4Da,最后經(jīng)分析軟件得出該肽的氨基酸組成及序列為HDDAPRF(His-Asp-Asp-Ala-Pro-Arg-Phe)。
　　 4.對(duì)棉籽蛋白的六種蛋白酶水解產(chǎn)物的ACE抑制能力進(jìn)行了比較,結(jié)果表明木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物的ACE抑制能力最高(85.61％)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,經(jīng)響應(yīng)面分析優(yōu)化,得到最佳酶解條件為:水解溫度為43.5℃,E/S為1.04％,pH值為7.5,該條件下制備的棉籽蛋白酶解物的水解度達(dá)

6、到25.69％,ACE抑制率達(dá)到88.15％。利用超濾技術(shù)將木瓜蛋白酶水解物分離為四個(gè)組分,分別為:LIF-Ⅰ(>30kDa),UF-Ⅱ(30～10kDa),UF-Ⅲ(10～5kDa),UF-Ⅳ(<5kDa),其中UF-Ⅳ(<5kDa)的ACE抑制能力最高(IC50=0.792±0.079mg/mL)；利用Sephadex G-25凝膠色譜將超濾組分中的UF-Ⅳ分成四個(gè)組分Fra.Ⅰ～Ⅳ,發(fā)現(xiàn)Fra.Ⅱ具有最高的ACE抑制能力(0.15

7、9±0.007mg/mL)。利用半制備RP-HPLC將Fra.Ⅱ分成9個(gè)組分,發(fā)現(xiàn)組分2有最強(qiáng)的ACE抑制能力。經(jīng)RP-HPLC再次鑒定組分2為單一組分。經(jīng)過MALDI-TOF-TOF二級(jí)質(zhì)譜分析鑒定ACE抑制肽Fra.Ⅱ-2的相對(duì)分子量為763.4Da,氨基酸序列為FPAIGMK(Phe-Pro-Ala-Ile-Gly-Met-Lys)。
　　 5.在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上,結(jié)合紙層析的方法改進(jìn)食物源ACE抑制肽體外活性的檢測(cè)方法,