細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Apr-3的克隆、細(xì)胞定位及多克隆抗體的制備.pdf

1、本研究通過(guò)克隆Apr-3的編碼區(qū)基因，對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞定位，并獲得了Apr-3原核表達(dá)蛋白和抗體，主要研究工作如下： 1.培養(yǎng)HL-60細(xì)胞，提取HL-60細(xì)胞總RNA，應(yīng)用RT-PCR獲取Apr-3的轉(zhuǎn)錄剪接體2的編碼區(qū)cDNA序列，將該cDNA與質(zhì)粒pcDNA3.1/myc-His(-)B連接，構(gòu)建克隆載體，將其轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，進(jìn)行測(cè)序。 2.測(cè)序正確后將該cDNA與質(zhì)粒pEGFP-C3連接，并將其轉(zhuǎn)染COS-

2、7細(xì)胞。熒光顯微鏡藍(lán)色激發(fā)光下觀(guān)察綠色熒光蛋白表達(dá)的部位。 3.培養(yǎng)HL-60細(xì)胞，提取HL-60細(xì)胞總RNA，應(yīng)用RT-PCR獲取Apr-3轉(zhuǎn)錄剪接體2編碼區(qū)cDNA序列的前366bp，將該cDNA與質(zhì)粒pcDNA3.0連接，構(gòu)建克隆載體，將其轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，進(jìn)行測(cè)序。 4.測(cè)序正確后將該cDNA與質(zhì)粒pET28a連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)獲得Apr-3蛋白。并用Ni柱對(duì)獲得蛋白進(jìn)行純化。

3、 5.用獲得的融合蛋白免疫新西蘭大白兔，制備兔多克隆抗體，用ELISA法檢測(cè)抗體滴度，用WesternBlot檢測(cè)Apr-3融合蛋白免疫學(xué)活性。 研究結(jié)果：對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析，與GenBank中登錄的Apr-3編碼區(qū)完全一致。pEGFP-Apr-3基因表達(dá)產(chǎn)物定位于COS-7細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。應(yīng)用RT-PCR獲取Apr-3編碼區(qū)cDNA序列的前366bp，將該cDNA與質(zhì)粒pcDNA3.0連接，構(gòu)建克隆載體，將其

4、轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，進(jìn)行測(cè)序，與GenBank中登錄序列比對(duì)，其結(jié)果正確后將該cDNA與質(zhì)粒pET28a連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)獲得Apr-3蛋白。Apr-3融合蛋白主要以包涵體形式存在。獲得兔多克隆抗體，ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)為：1∶4000。用WesternBlot檢測(cè)Apr-3融合蛋白免疫學(xué)活性，顯示原核表達(dá)的蛋白可與多克隆抗體特異結(jié)合。 研究結(jié)論：對(duì)Apr-3基因的一個(gè)轉(zhuǎn)錄剪接體進(jìn)行克隆，構(gòu)