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文檔簡介
1、s-lap是本實驗室利用mRNA差異顯示技術(shù)在可見光誘導(dǎo)的凋亡早期的豬視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞中克隆的一個新的基因,GenBank登錄號為AF509472。s-lap基因具有一個開放閱讀框架,可編碼101個氨基酸。因為s-lap基因的mRNA只表達(dá)在可見光損傷的RPE細(xì)胞,而在正常的RPE細(xì)胞中則不表達(dá),因此我們推測該基因與可見光所致的RPE細(xì)胞損傷具有密切關(guān)系,但對s-lap的作用及機(jī)制尚不清楚。 本研究首先構(gòu)建了pcDN
2、A3.1/s-lap/GFP真核表達(dá)載體,并通過轉(zhuǎn)染四種哺乳動物細(xì)胞來觀察s-lap蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位,結(jié)果表明s-lap蛋白分布在整個細(xì)胞,但以細(xì)胞核表達(dá)為主,提示s-lap可能在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用。 因為s-lap是在光損傷的凋亡早期的RPE細(xì)胞中表達(dá)的一個基因,所以我們進(jìn)一步對s-lap的超表達(dá)與細(xì)胞凋亡之間的相關(guān)性進(jìn)行了研究。雖然基因組電泳結(jié)果顯示在超表達(dá)s-lap基因的293T細(xì)胞中沒有出現(xiàn)標(biāo)志細(xì)胞凋亡的DNA梯狀帶,但超
3、表達(dá)s-lap基因后的細(xì)胞周期檢測結(jié)果卻表明,s-lap/GFP融合蛋白可使293T細(xì)胞周期發(fā)生明顯的改變,可使G2/M期明顯阻滯。推測s-lap基因可能通過影響細(xì)胞周期來參與細(xì)胞凋亡的過程。 為了進(jìn)一步研究s-lap蛋白的組織分布及其功能,制備抗s-lap抗體是十分重要的。因此我們構(gòu)建了pET-28a(+)/s-lap原核表達(dá)載體,并在大腸桿菌BL21中通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá),然后利用Ni2+柱進(jìn)行親和層析對重組蛋白進(jìn)行純化。用
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