硒化合物調(diào)控凋亡相關(guān)microRNA誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡.pdf

1、目的:探討二氧化硒(SeO2)對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及其表觀調(diào)控機(jī)制,明確硒化合物抗腫瘤作用的機(jī)制,為其作為抗癌藥物的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:1.細(xì)胞培養(yǎng)與分組:選擇不同 HPV亞型宮頸癌細(xì)胞株 Hela細(xì)胞、Caski細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,用含10％FBS的 RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞,置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組予不同濃度 SeO2(1.875μmol/L、

2、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L)處理24h,空白對(duì)照組予無(wú)血清培養(yǎng)基。根據(jù)待測(cè)指標(biāo)需要取樣待測(cè)。
　　2.指標(biāo)檢測(cè):倒置光學(xué)顯微鏡下觀察不同組兩株細(xì)胞株經(jīng)過(guò) SeO2處理后的形態(tài)學(xué)變化;用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè) SeO2對(duì)細(xì)胞增殖及活力的影響;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率;用 Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白 Caspase-3、P53蛋白表達(dá)的水平;St

3、ep-loop實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān) microRNA(miRNA) let-7a的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1.形態(tài)學(xué)觀察:倒置光學(xué)顯微鏡下可見,SeO2對(duì)體外培養(yǎng)的宮頸癌細(xì)胞株生長(zhǎng)形態(tài)均產(chǎn)生明顯影響。與對(duì)照組細(xì)胞相比,細(xì)胞變圓皺縮,胞內(nèi)顆粒增多,失去正常形態(tài),貼壁細(xì)胞減少,增殖減慢;隨著 SeO2作用濃度的提高,細(xì)胞密度逐漸降低,細(xì)胞間間隙逐步增大,呈劑量依賴性。
　　2.細(xì)胞增殖活力分析:采用 MTT法檢測(cè) S

4、eO2對(duì)不同宮頸癌細(xì)胞株抑制作用,結(jié)果示 SeO2對(duì)宮頸癌細(xì)胞株的抑制作用呈量效依賴關(guān)系,Hela細(xì)胞各實(shí)驗(yàn)組(1.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L)細(xì)胞抑制率分別為1.22%、20.25%、35.03%、43.56%、60.74%,其中7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L濃度組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05);SeO2對(duì) Caski細(xì)胞的抑制作用隨藥物濃

5、度的升高亦呈明顯上升趨勢(shì),各實(shí)驗(yàn)組(1.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L)細(xì)胞抑制率分別為14.39%、34.08%、43.01%、57.73%、68.65%,與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　3.凋亡檢測(cè):運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度 SeO2對(duì)宮頸癌細(xì)胞株的凋亡誘導(dǎo)作用。隨著 SeO2藥物濃度的升高,誘導(dǎo)作用逐漸增強(qiáng),呈濃度依賴性。0μmol/L、1

6、.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L濃度 SeO2誘導(dǎo) Hela細(xì)胞凋亡率分別為3.12%、30.56%、33.42%、37.50%、45.43%、69.38%,0μmol/L、1.875μmol/L、3.75μmol/L、7.5μmol/L、15μmol/L、30μmol/L濃度 SeO2誘導(dǎo) Caski細(xì)胞凋亡率分別為3.7%、10.7%、67.5%、78.2%、87.1

7、%、85.2%,凋亡率均隨藥物濃度增加呈上升趨勢(shì)。
　　4. Caspase-3、P53蛋白表達(dá)水平測(cè)定:采用 Western blot技術(shù)分析不同細(xì)胞組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示 SeO2可明顯上調(diào)宮頸癌細(xì)胞株中 Caspase-3與 P53蛋白水平。對(duì) Hela細(xì)胞的 Caspase-3、P53蛋白表達(dá)上調(diào)作用于7.5μmol/L處達(dá)到峰值,各實(shí)驗(yàn)組較空白組均有顯著差異(P<0.05)。Caski細(xì)胞中低濃度組 Caspa

8、se-3蛋白誘導(dǎo)作用不明顯,至7.5μmol/L、15μmol/L及30μmol/L濃度蛋白表達(dá)量較空白組有顯著差異(P<0.05)。各實(shí)驗(yàn)組對(duì) P53蛋白水平的誘導(dǎo)作用較空白組均有顯著差異(P<0.05)。
　　5. Let-7a表達(dá)水平分析:Step-loop實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè)不同組宮頸癌細(xì)胞株凋亡相關(guān) miRNA let-7a表達(dá),結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞 let-7a表達(dá)水平顯著提高,在7.5μmol/L處出現(xiàn)峰值,-⊿⊿Ct