UL29shRNA表達(dá)質(zhì)粒與ACV對(duì)HSV-2抑制效果的比較.pdf

1、目的:針對(duì)單純皰疹病毒Ⅱ型(Herpes simplex virus type2, HSV-2)的UL29基因,構(gòu)建了4組短發(fā)夾RNA(Small hairpin RNA, shRNA)表達(dá)質(zhì)?！猵GPU6/GFP/Neo/shRNA UL29,并對(duì) UL29shRNA表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行了篩選。通過(guò)將篩選的 UL29shRNA表達(dá)質(zhì)粒與抗病毒藥物阿昔洛韋(Aciclovir, ACV)的抗病毒效果及細(xì)胞毒性進(jìn)行比較,探討RNA干擾在細(xì)胞水平上

2、對(duì)HSV-2病毒的抑制效果。
　　方法:根據(jù)shRNA的一般設(shè)計(jì)原則,針對(duì)HSV-2的UL29基因設(shè)計(jì)出四組表達(dá)質(zhì)粒,通過(guò)病變抑制率、mRNA相對(duì)表達(dá)量從中篩選出一組干擾效果最好的表達(dá)質(zhì)?！猆L29-shRNA1641。以pGPU6/GFP/Neo/UL29-shRNA1641作為RNA干擾組與抗病毒藥ACV進(jìn)行對(duì)HSV-2的抑制效果的比較研究。預(yù)實(shí)驗(yàn)中通過(guò)CCK-8(Cell Counting Kit-8)法測(cè)定ACV的最大無(wú)毒

3、濃度(maximal atoxic concentration, TC0)和ACV的半數(shù)有效濃度(Half effective concentration, EC50),分別用于病毒抑制效果的實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)。UL29-shRNA1641與ACV抑制HSV-2的實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組:RNAi組、ACV組和RNAi+ACV組。采用CCK-8法檢測(cè)病變抑制率,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time fluorescent quantita

4、tive PCR, RT-PCR)檢測(cè)UL29mRNA的相對(duì)表達(dá)量, Karber法檢測(cè)細(xì)胞上清液中病毒滴度的變化、蛋白印跡法(Western blot)檢測(cè)ICP8的相對(duì)表達(dá)量,對(duì) RNAi與 ACV抑制效果進(jìn)行比較;通過(guò) WST-1(Water-Soluble Tetrazolium-1)法和臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法對(duì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染復(fù)合物(質(zhì)粒+轉(zhuǎn)染試劑)和ACV的細(xì)胞毒性進(jìn)行比較。
　　結(jié)果:(1)通過(guò)病變抑制率、mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)表

5、明,4組UL29shRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)HSV-2均有一定的抑制效果,以其中UL29-shRNA1461對(duì)基因表達(dá)抑制率最高,為最佳干擾組。(2)預(yù)實(shí)驗(yàn)中 Karber法測(cè)定擴(kuò)增后的病毒滴度為 TCID50=10-5.375/100μl,CCK-8法測(cè)定ACV的TC0和EC50分別為5.0μg/ml和31.7μg/ml。(3)CCK-8法檢測(cè)病變抑制率的結(jié)果顯示,RNAi組、ACV組和RNAi+ACV組細(xì)胞病變抑制率分別為35.35±0.9

6、8％、43.95±1.31%和85.82±1.13%,其中RNAi組比ACV組病變抑制率低(P﹤0.05),RNAi+ACV組的病變抑制率明顯高于RNAi組和ACV組(P﹤0.05)。(4)RT-PCR檢測(cè)三組mRNA的相對(duì)表達(dá)水平,RNAi組、ACV組和RNAi+ACV組均能不同程度降低mRNA相對(duì)表達(dá)量。RNAi組UL29基因相對(duì)表達(dá)量高于ACV組(P﹤0.05);RNAi+ACV組UL29基因相對(duì)表達(dá)量明顯低于RNAi組和ACV組

7、(P﹤0.05)。(5)Karber法檢測(cè)三組細(xì)胞上清液病毒滴度表明,陰性對(duì)照組的上清病毒滴度為10-5.4±0.3/100μl,RNAi組、ACV組和RNAi+ACV組上清液病毒滴度分別為10-4.0±0.2/100μl、10-3.7±0.2/100μl和10-2.9±0.3/100μl,三組與陰性對(duì)照相比均有顯著性差異(P﹤0.05),RNAi組病毒滴度高于ACV組(P﹤0.05),RNAi+ACV組的病變病毒滴度明顯低于RNAi組

8、和ACV組(P﹤0.05)。(6)Western blot檢測(cè)ICP8相對(duì)表達(dá)量, RNAi組、ACV組和 RNAi+ACV組均能不同程度降低 ICP8表達(dá),ACV組的 ICP8相對(duì)表達(dá)量比RNAi組低(P﹤0.05)。RNAi+ACV組ICP8相對(duì)表達(dá)量降低最為明顯,與ACV組和RNAi組相比有顯著差異(P﹤0.05)。(7)WST-1法對(duì)轉(zhuǎn)染復(fù)合物與ACV的細(xì)胞毒性進(jìn)行比較, RNAi組和 ACV組細(xì)胞死亡率分別為23.65±1.3

9、3%和39.48±1.25%;臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法對(duì)轉(zhuǎn)染復(fù)合物和 ACV的細(xì)胞毒性進(jìn)行比較,RNAi組和ACV組細(xì)胞死亡率分別為18.55±1.98%和42.22±3.23%。RNAi組與ACV組相比均有顯著性差異(P﹤0.05)。說(shuō)明RNAi中質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞的毒性明顯小于ACV。
　　結(jié)論:設(shè)計(jì)的4組UL29shRNA表達(dá)質(zhì)粒均能抑制UL29基因和ICP8的表達(dá)。其中UL29-shRN1461干擾果最好。以UL29-shRN1