TGEV S基因B和C抗原位點(diǎn)片段的真核表達(dá)及與原核表達(dá)產(chǎn)物抗原性的比較.pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV)是冠狀病毒科、冠狀病毒屬成員，引起豬的傳染性胃腸炎(Transmissiblegastroenteritis，TGE)，感染仔豬死亡率很高，呈世界范圍分布，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。TGEV與豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的疾病在臨床癥狀上很相似，基因組結(jié)構(gòu)上豬呼吸道冠狀病毒(PRCV)與TGEV具有較高的同源性，傳統(tǒng)方法很難鑒別診斷。

2、 為診斷TGEV感染及對(duì)TGEV進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，本研究采用真核表達(dá)系統(tǒng)(桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng))表達(dá)TGEV纖突蛋白(S蛋白)含有B和C抗原位點(diǎn)(在PRCV中缺失)的重組蛋白，并與原核表達(dá)的含有B和C抗原位點(diǎn)的重組蛋白進(jìn)行了抗原性分析比較。 應(yīng)用PCR方法體外擴(kuò)增了TGEVTH-98株S基因5’端含有B、C抗原位點(diǎn)的片段(TG)，大小為687bp。將TG片段亞克隆至真核表達(dá)載體pBlueBacHis2A中，將鑒定為陽(yáng)性的

3、重組質(zhì)粒純化，與線性化的桿狀病毒共轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞，經(jīng)3輪蝕斑篩選，獲得了純化的重組病毒。制備高滴度的重組病毒，實(shí)現(xiàn)了在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)。優(yōu)化表達(dá)條件后，對(duì)表達(dá)蛋白的可溶性進(jìn)行了分析，獲得了可溶性的重組蛋白。SDS-PAGE分析表明：重組蛋白大小約為33KD，WesternBlotting檢測(cè)結(jié)果表明，在桿狀病毒/昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的重組蛋白在變性條件下不能被多克隆抗體特異性識(shí)別。純化了原核表達(dá)的含有B和C抗原位點(diǎn)的重組蛋白，