PDCD5基因重組質粒的構建及其轉染KM3細胞后的表達.pdf

1、目的:構建pYr-ads-4-PDCD5重組質粒，利用脂質體介導轉染于多發(fā)性骨髓瘤KM3細胞，并檢測PDCD5的表達，為后續(xù)進行PDCD5基因促進多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡機制的研究提供工具、奠定基礎。
　　 方法:以pCMV-SPORT6-PDCD5為模板擴增PDCD5基因編碼區(qū)（CDS區(qū)）。瓊脂糖凝膠電泳鑒定成功后，將其與pYr-adshuttle-4載體質粒雙酶切連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，培養(yǎng)于含卡那霉素(K

2、an)培養(yǎng)基上，挑取陽性克隆進行雙酶切鑒定，并將酶切正確的pYr-ads-4-PDCD5送去測序，把測序結果與欲得到的目的序列比對，從而判斷pYr-ads-4-PDCD5重組質粒是否構建成功。pYr-ads-4-PDCD5構建成功后，大量擴增及大量抽提質粒。設轉染目的基因組、轉染空載體組、未轉染組三組，利用LipofectamineTM2000脂質體介導pYr-ads-4-PDCD5轉染于多發(fā)性骨髓瘤KM3細胞株，48小時后在熒光顯微鏡

3、下觀察轉染效率，并予實時熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR，qPCR)、蛋白免疫印跡術(Westernblot)分別檢測PDCD5在KM3細胞中的mRNA水平和蛋白水平的表達。
　　 結果:PCR擴增PDCD5基因CDS，瓊脂糖凝膠電泳獲得大約400bp的目的基因，與PDCD5 CDS區(qū)大小相符，擴增成功。與pYr-adshuttle-4載體質粒酶切、連接，連接產物經轉化、培養(yǎng)后，雙酶切鑒定切出

4、約400bp的PDCD5目的基因片段帶和約7000bp的載體片段帶。將酶切正確的pYr-ads-4-PDCD5基因測序結果與欲得到的目的序列比對，顯示擴增出的PDCD5基因片段序列完全正確，證明pYr-ads-4-PDCD5重組質粒構建成功。脂質體LipofectamineTM2000介導轉染KM3細胞48小時后，目的基因組和空載體組熒光顯微鏡下觀察轉染效率約為45％，實時熒光定量PCR及Western blot測定PDCD5 mRNA