雞傳染性支氣管炎重組雞痘疫苗免疫效力的研究.pdf

1、雞傳染性支氣管炎(AvianInfectiousBronchitis)是由冠狀病毒屬的冠狀病毒引起的高度接觸性傳染病，是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的重要疾病之一。我國(guó)在防制雞傳染性支氣管炎過(guò)程中，目前通常采用馬薩諸塞(Massachusetts)血清型疫苗H120,H52，還有許多由地方分離株通過(guò)雞胚致弱制備的商品化活疫苗。但由于我國(guó)大量雞傳染性支氣管炎病毒不同血清型的出現(xiàn)，對(duì)感染異種IBV分離株而發(fā)病的免疫雞群不能提供完全的保護(hù)作用，造成了我國(guó)免

2、疫雞群中IB頻繁發(fā)生的原因之一。禽痘病毒載體疫苗在生產(chǎn)實(shí)踐中已被證實(shí)為一種安全有效的疫苗，部分產(chǎn)品已經(jīng)投入使用。本課題組已構(gòu)建rFPV-S1-IFNγ和rFPV-S1，前期試驗(yàn)效果良好。本研究對(duì)其免疫效力進(jìn)行了重組雞痘病毒疫苗同弱毒疫苗比較試驗(yàn)、最小免疫劑量測(cè)定、安全性、遺傳穩(wěn)定性、不同條件保存對(duì)疫苗效價(jià)的影響等工作，為疫苗進(jìn)一步的中試和推廣作鋪墊。 為了檢測(cè)重組病毒的遺傳穩(wěn)定性，rFPV-S1-IFNγ與rFPV-S1用雞胚成

3、纖維細(xì)胞接種傳代至30代，取第15、20、25、30代重組病毒作為受檢代次。病毒蝕斑檢測(cè)證明，重組病毒的效價(jià)在2×105上下波動(dòng)，X-gal顯色后所有蝕斑均呈藍(lán)色；提取重組病毒基因組DNA，分別用S1和雞Ⅱ型干擾素基因基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，4個(gè)代次的重組病毒rFPV-S1-IFNγ均檢測(cè)到了大小分別為660bp和500bp目的片段，在重組病毒rFPV-S1中也均檢測(cè)到了660bp的S1基因特異性片段，序列測(cè)定表明2個(gè)外源基因在細(xì)

4、胞傳代過(guò)程中沒(méi)有發(fā)生核苷酸和氨基酸的改變；間接免疫熒光檢測(cè)顯示各代次重組病毒中插入的外源基因均能表達(dá)，在熒光顯微鏡下觀察到了特異性熒光。結(jié)果表明，重組雞痘病毒具有較好的遺傳穩(wěn)定性，經(jīng)過(guò)30代的傳代后外源基因能夠穩(wěn)定表達(dá)。 將共表達(dá)傳染性支氣管炎病毒S1基因和雞Ⅱ型干擾素基因的重組雞痘病毒用生理鹽水恢復(fù)至原體積，取0.1ml翅膀內(nèi)側(cè)無(wú)血管處接種1周齡SPF雞(相當(dāng)于1.0×105PFU/羽)。結(jié)果表明，即使采用原倍重組疫苗注射試驗(yàn)

5、雞也不會(huì)引起試驗(yàn)雞發(fā)病，重組疫苗對(duì)試驗(yàn)雞是安全的。 將100只4周齡SPF雞分為4個(gè)組，分別免疫rFPV-S1-IFNγ、rFPV-S1、H120，并設(shè)PBS對(duì)照，免后4周用IBVLX4株攻擊。結(jié)果13/22的雞免疫rFPV-S1-IFNγ后能獲得保護(hù)，rFPV-S1免疫組和H120的保護(hù)率分別是18/24和17/22。rFPV-S1-IFNγ免疫后能縮短IBV呼吸道排毒時(shí)間及病毒抗原在腎臟組織中存在時(shí)間，僅在攻毒后的6-8d可

6、以在喉拭子和腎臟組織中檢測(cè)到病毒和病毒抗原，比rFPV-S1和H120弱毒疫苗免疫組分別縮短了2d。H120弱毒疫苗和重組雞痘病毒免疫組肝、脾、腎、肺和氣管的病理變化輕微，rFPV-S1-IFNγ免疫組在攻毒后的第16d觀察到病理變化，比rFPV-S1和H120弱毒疫苗免疫組攻毒后病變持續(xù)時(shí)間短了4d.試驗(yàn)雞的血清學(xué)和外周血T淋巴細(xì)胞亞群的監(jiān)測(cè)表明，疫苗接種后3周全部實(shí)驗(yàn)雞均為IBV抗體陽(yáng)性，其中，H120弱毒疫苗免疫組抗體水平最高，其

7、次是rFPV-S1免疫組，rFPV-S1-IFNγ免疫組的抗IBV抗體水平最低。除了rFPV-S1-IFNγ免疫組CD4+T淋巴細(xì)胞攻毒前下降較為明顯，TCRγδ+和CD8+T淋巴細(xì)胞比例是最高的，其余各免疫組外周血CD4+T、CD8+T和TCRγδ+淋巴細(xì)胞變化水平比較平穩(wěn)。上述試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明rFPV-S1-IFNγ促進(jìn)了CD8+T淋巴細(xì)胞的成熟，抑制外周血中CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量。提高了機(jī)體的細(xì)胞免疫水平，限制了機(jī)體B淋巴細(xì)胞的活化以

8、及特異性抗體的產(chǎn)生；同時(shí)，rFPV-S1-IFNγ還能抑制活疫苗免疫接種引起的試驗(yàn)雞增重降低作用，rFPV-S1-IFNγ的免疫試驗(yàn)雞的增重沒(méi)有受到疫苗接種的影響，與rFPV-S1和H120弱毒疫苗免疫組有顯著差異。 Ⅰ將rFPV-S1-IFNγ和rFPV-S1分別10倍滴度稀釋后接種4周齡SPF雞(1.0×104PFU/羽、1.0×103PFU/羽、1.0×102PFU/羽、1.0×10PFU/羽)，免后4周用IBVLX4株攻

9、擊。結(jié)果表明，rFPV-S1-IFNγ免疫后，當(dāng)免疫劑量大于100PFU時(shí)，rFPV-S1-IFNγ免疫組的保護(hù)率在72％以上。最高可以達(dá)到91.7％；rFPV-S1免疫后，不同劑量(10PFU、100PFU、1000PFU和10000PFU)免疫組對(duì)強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)率在60％-70％之間。同時(shí)將重組雞痘疫苗分別放置于-20℃、4℃和常溫條件下保存，測(cè)定其疫苗效價(jià)是否變化。結(jié)果表明重組雞痘凍干疫苗在-20℃條件下保持1年效價(jià)變化甚微，在4