糖基化磷脂酰肌醇（GPI）錨定型人B7-1基因重組蛋白錨定自體腫瘤細胞膜對提高CTL殺傷泌尿系統(tǒng)腫瘤細胞的研究.pdf

1、　　本項研究依據(jù)腫瘤免疫過程中共刺激因子B7的作用，和GPI錨定信號的理論和方法，利用分子生物學手段，將B7胞外區(qū)編碼序列同天然GPI蛋白衰變加速因子(DAF)C端編碼34個氨基酸的錨定信號的基因序列重組，將重組基因插入真核表達載體pCDNA3，構建表達載體pCDNA3-GPI-B7-1，與質(zhì)粒pSV2-dhfr共轉(zhuǎn)染CHO/DHFR-細胞，經(jīng)G418篩選和MTX加壓，篩選出穩(wěn)定表達目的蛋白的細胞株，目的蛋白GPI·B7-1分離純化后，

2、經(jīng)WesternBlot檢測活性。提純的目的蛋白錨定于小鼠前列腺癌細胞(RM-1)細胞膜上，免疫小鼠后，一組小鼠取脾細胞檢測CTL功能和T細胞擴增情況，另一組小鼠進行腫瘤接種實驗，探討GPI·B7-1作為腫瘤疫苗的意義。并進一步探討利用GPI錨定蛋白轉(zhuǎn)化法制備腫瘤疫苗在抗腫瘤免疫反應中的應用前景。結(jié)果和結(jié)論如下：1.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將表達質(zhì)粒pCDNA3-GPI-B7-1和質(zhì)粒pSV2-dhfr共轉(zhuǎn)染CHO/DHFR-細胞，經(jīng)G418篩

3、選和MTX加壓，獲得長久穩(wěn)定表達GPI·B7-1蛋白的轉(zhuǎn)染細胞株。而且因選用二氫葉酸還原酶缺陷型CHO細胞，共轉(zhuǎn)染的pSV2-dhfr質(zhì)粒帶動目的蛋白大量表達。表達產(chǎn)物經(jīng)流式細胞術和直接免疫熒光染色證實，而且目的蛋白GPI·B7-1可被糖基化磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PIPLC)特異性酶解，表明目的蛋白是以GPI蛋白形式表達于哺乳動物細胞表面。2.分離提取的GPI·B7-1蛋白經(jīng)WesternBlot檢測具有免疫活性，并可錨定在C57B