胞內(nèi)段氨基酸序列對(duì)corin在細(xì)胞膜錨定及活化的影響.pdf

1、目的：Corin是心臟中發(fā)現(xiàn)的一種II型跨膜絲氨酸蛋白酶(Type II Transmembrane Serine Protease,TTSP),通過(guò)氨基末端跨膜區(qū)域錨定在細(xì)胞膜上。與許多絲氨酸蛋白酶一樣,corin以無(wú)活性酶原形式在核糖體中合成,經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體,錨定在細(xì)胞膜上,從而發(fā)揮其生物學(xué)功能?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道,某些跨膜蛋白的胞內(nèi)近膜區(qū)氨基酸序列在其細(xì)胞膜錨定與活化中起重要作用。Corin蛋白含有一個(gè)短的氨基端胞質(zhì)尾部,有研究表明

2、人corin蛋白氨基端胞內(nèi)段的“天冬氨酸-天冬氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺”(Asp-Asp-Asn-Asn,DDNN)基序,可以影響 corin蛋白在細(xì)胞膜的錨定和活化。但是,小鼠 corin胞內(nèi)段不含有DDNN基序,長(zhǎng)短也不同于人corin。因此,我們推斷小鼠corin胞內(nèi)段可能存在其它的影響corin在細(xì)胞膜錨定與活化的序列。目前尚未有相關(guān)研究報(bào)道。本文從胞內(nèi)段近膜區(qū)的氨基酸序列和跨膜區(qū)胞內(nèi)側(cè)的電荷兩方面,在國(guó)內(nèi)外率先開展工作,研究胞

3、內(nèi)段結(jié)構(gòu)對(duì)小鼠corin在細(xì)胞膜的錨定與活化的影響,從而闡明corin的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,揭示II型跨膜絲氨酸蛋白酶在細(xì)胞膜錨定的機(jī)制。
　　方法：⑴以小鼠野生型corin質(zhì)粒mE1a為模板,用Vector NTI軟件設(shè)計(jì)引物,利用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)(QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit)構(gòu)建一系列胞內(nèi)段截短型corin表達(dá)載體及其它c(diǎn)orin突變體。⑵將野生型及突變

4、corin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚腎(human embryonic kidney,HEK)293細(xì)胞,制備細(xì)胞裂解液,蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)重組corin蛋白在細(xì)胞漿內(nèi)的表達(dá)及活化情況。⑶利用生物素標(biāo)記細(xì)胞膜蛋白和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)截短型/突變體 corin在細(xì)胞膜表面的表達(dá)情況。⑷將野生和突變corin表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到pro-ANP穩(wěn)定表達(dá)的HEK293細(xì)胞中,Western blotting檢測(cè)上清中的pro-AN

5、P和ANP,評(píng)估基因突變對(duì)corin功能的影響。
　　結(jié)果：①分別去掉胞內(nèi)段50和99個(gè)氨基酸殘基,構(gòu)建小鼠截短型corin mD50和mD99表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,Western blotting檢測(cè)細(xì)胞裂解液中corin的表達(dá)與活化,與野生型corin mE1a相比,mD50對(duì)corin蛋白的表達(dá)和活化都沒(méi)有影響,mD99對(duì)corin蛋白表達(dá)沒(méi)有影響,但是,mD99 corin蛋白的活化量顯著增加(29.00±0.3

6、2％vs.12.48±1.89％,p=0.0001,n=4)。我們還分別用生物素標(biāo)記細(xì)胞表面蛋白和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)corin在細(xì)胞膜的表達(dá),發(fā)現(xiàn)mD99在細(xì)胞膜上的表達(dá)量顯著增加。結(jié)果提示:氨基端胞內(nèi)段第50到第99個(gè)氨基酸之間存在抑制小鼠corin蛋白在細(xì)胞表面表達(dá)和活化的序列。②分別去掉胞內(nèi)段60、70和75個(gè)氨基酸,構(gòu)建表達(dá)載體mD60、mD70和mD75。轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,Western blotting檢測(cè)corin的表達(dá)與

7、活化,發(fā)現(xiàn)這些突變不影響corin在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),但與野生型corin mE1a相比,mD75的活化顯著增加(28.73±0.01％vs.16.63±0.04％,p=0.02,n=3)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染mD75的HEK293細(xì)胞表面corin陽(yáng)性率明顯高于野生型corin mE1a(76.34±4.43％vs.40.04±5.10％,p=0.0017,n=4)。據(jù)此,我們推測(cè)抑制序列位于第70到第75個(gè)氨基酸之間。③從胞內(nèi)段依次

8、去掉71、72、73和74個(gè)氨基酸,構(gòu)建表達(dá)載體mD71、mD72、mD73和mD74。轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與野生型 corin mE1a相比,突變體在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)未受影響,但 mD72、mD73和mD74corin蛋白的活化量顯著增加。推斷:氨基端胞內(nèi)段第72位的苯丙氨酸可能對(duì)小鼠corin蛋白在細(xì)胞膜錨定活化起重要作用。以mE1a為模板,分別將71位賴氨酸(Lys,K)、72位苯丙氨酸(P

9、he,F)和73位的谷氨酰胺(Gln,Q)突變成丙氨酸(Ala,A),即K71A、F72A和Q73A,并構(gòu)建表達(dá)載體K71A/F72A/Q73A。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)突變體 K71A、F72A和 Q73A對(duì)corin的表達(dá)和活化都沒(méi)有影響,而K71A/F72A/Q73A不影響corin的表達(dá),但與野生型corin mE1a相比,活化量顯著增加(28.69±1.29％vs.19.58±1.42

10、％,p=0.009,n=3)。提示氨基端胞內(nèi)段第71、72和73位的KFQ基序可以抑制小鼠corin蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá)和活化。④為研究小鼠corin蛋白錨定到細(xì)胞膜上最少需要幾個(gè)氨基酸殘基,我們以mE1a為模板,從小鼠corin的胞內(nèi)段依次去除106、111和112個(gè)氨基酸殘基,構(gòu)建mD106、mD111和mD112。轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,研究發(fā)現(xiàn)這些突變不影響corin在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá),但corin mD112不能被活化;流式細(xì)胞術(shù)檢

11、測(cè)也發(fā)現(xiàn)突變體mD112幾乎不在膜上表達(dá);Western blotting檢測(cè)corin的功能,也發(fā)現(xiàn)mD112不能將pro-ANP活化為ANP,即不具有生物學(xué)功能。說(shuō)明小鼠corin蛋白氨基端胞內(nèi)段起始氨基酸甲硫氨酸(methionine,Met)和膜內(nèi)側(cè)的精氨酸對(duì)corin在細(xì)胞膜錨定非常重要。⑤研究了胞內(nèi)側(cè)氨基酸的電荷對(duì)小鼠corin蛋白在細(xì)胞膜上的錨定和活化的影響。以mD111為模板,把胞內(nèi)段第112位精氨酸(Arg,R)突變成

12、丙氨酸(Ala,A)、天冬氨酸(Asp,D)和賴氨酸(Lys,K)分別得到突變體D-R112A、D-R112D和D-R112K。轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)突變對(duì)corin在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)沒(méi)有影響。但是D-R112A和D-R112D corin蛋白不能被活化,而精氨酸變成同樣帶正電荷的賴氨酸之后,D-R112K corin蛋白可以正常被活化。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)只有胞內(nèi)段氨基酸帶正電荷時(shí),corin蛋白才能在膜上表達(dá)并具有生物學(xué)功能。從而推

13、測(cè), corin蛋白在胞內(nèi)段除起始甲硫氨酸外,只需要一個(gè)帶正電荷的氨基酸就可以錨定到細(xì)胞膜上。為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們的結(jié)論,我們以mE1a為模板,分別把112位精氨酸(Arg, R)突變成丙氨酸(Ala,A)、天冬氨酸(Asp,D)、谷氨酸(Glu,E)、賴氨酸(Lys, K)和組氨酸(His,H),得到突變體 R112A、R112D、R112E、R112K和 R112H。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,Western blotting和流式細(xì)胞

14、術(shù)檢測(cè)都證實(shí)當(dāng)112位是正電荷氨基酸時(shí),corin蛋白可以在細(xì)胞膜上錨定和活化,變成帶負(fù)電荷或者中性氨基酸時(shí), corin蛋白就不能錨定到細(xì)胞膜上。
　　結(jié)論：⑴KFQ基序是小鼠corin蛋白胞內(nèi)段存在的一個(gè)抑制corin向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)及活化的信號(hào)。⑵小鼠corin蛋白僅需要一個(gè)位于胞內(nèi)段112位精氨酸就可以錨定到質(zhì)膜上被活化成為有功能的蛋白。⑶近膜區(qū)的正電荷是小鼠corin蛋白在細(xì)胞膜錨定所必需的,且正電性越強(qiáng)越利于蛋白在細(xì)胞膜上