miR-106a和miR-17-5p在反式二羥環(huán)氧苯并芘誘導(dǎo)細(xì)胞惡變中的作用.pdf

1、背景與目的:苯并[a]芘（B[a]P）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的廣泛分布于環(huán)境中的環(huán)境化學(xué)致癌物，其經(jīng)代謝激活產(chǎn)生最終致癌物anti-BPDE后才具有致癌性。MiRNA是一類數(shù)量眾多的非編碼小RNA分子，能夠通過與靶基因的3’端非翻譯區(qū)配對(duì)結(jié)合引起翻譯抑制或mRNA的降解而起到癌基因或抑癌基因的作用。本研究中，利用anti-BPDE誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化人類支氣管上皮細(xì)胞(16HBE-T)探討miRNA在化學(xué)致癌中的可能機(jī)制。使用qRT-PCR法測(cè)量mi

2、R-106a成熟體和miR-17-5p成熟體的表達(dá)水平，并進(jìn)一步使用了特異的miRNA抑制劑和模擬物下調(diào)或上調(diào)惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞里的miR-106a或miR-17-5p活性，以此來確定其表達(dá)高低對(duì)惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。
　　 結(jié)果顯示，與對(duì)照細(xì)胞相比(16HBE-N)，miR-106a和miR-17-5p在惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中存在過度表達(dá)。轉(zhuǎn)染抑制劑沉默16HBE-T細(xì)胞的miR-106a或miR-17-5p后會(huì)抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)

3、胞周期阻滯和凋亡、抑制非依賴性生長(zhǎng)。相反，轉(zhuǎn)染模擬物上調(diào)16HBE-T細(xì)胞中的miR-106a或miR-17-5p水平后細(xì)胞表現(xiàn)出完全相反的特性。此外，對(duì)miR-106a還進(jìn)行了裸鼠實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射了轉(zhuǎn)染miR-106a抑制劑的細(xì)胞的腫瘤組生長(zhǎng)速度明顯減緩，而注射了轉(zhuǎn)染miR-106a模擬物的細(xì)胞的腫瘤組生長(zhǎng)速度顯著增快。這些結(jié)果表明miR-106a和miR-17-5p在化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化中可能起到癌基因的作用。因此，敲除惡變細(xì)胞

4、中的miR-106a和miR-17-5p可能是一種潛在的治療方法。
　　 方法:
　　 1.檢測(cè)miRNA的表達(dá)
　　 使用TaqMan MicroRNA assays試劑盒鑒定16HBE-N和16HBE-T細(xì)胞中miRNA的表達(dá)水平。
　　 2.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA模擬物和抑制劑
　　 按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。模擬物轉(zhuǎn)染組設(shè)試驗(yàn)組（miR-106a mimic和

5、miR-17-5p mimic）和陰性對(duì)照組（mimic NC），抑制劑轉(zhuǎn)染組設(shè)試驗(yàn)組（anti-miR-106a和anti-miR-17-5p）和陰性對(duì)照組（inhibitor NC），此外，還設(shè)置了轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000陰性對(duì)照組（Lipo-2000 NC）。轉(zhuǎn)染5小時(shí)后評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率，72小時(shí)后檢測(cè)miRNA表達(dá)水平改變情況。
　　 3.細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)
　　 轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，用PI和Rnase A

6、著色，以流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。
　　 4.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
　　 在96孔板里接種相同數(shù)量的16HBE-T細(xì)胞后，培養(yǎng)24小時(shí)，再分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后第五天用CCK-8試劑和酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。
　　 5.凋亡實(shí)驗(yàn)
　　 轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，使用Annexin V/PI試劑盒和流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染和非轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡率。
　　 6.軟瓊脂實(shí)驗(yàn)
　　 將500個(gè)細(xì)胞重懸于1ml 0.3％低熔點(diǎn)

7、瓊脂糖，然后鋪到已含1ml 0.6％半固體低熔點(diǎn)瓊脂糖的12孔板里。低熔點(diǎn)瓊脂糖用含10％血清的培養(yǎng)基配置。放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3周后，計(jì)算克隆數(shù)。
　　 7.裸鼠試驗(yàn)
　　 轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，收集轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，用PBS重懸細(xì)胞使細(xì)胞密度為1×107個(gè)/ml，取0.2 ml皮下注射入5周齡的BALB/c裸鼠后腿內(nèi)側(cè)。成瘤后每五天測(cè)量腫瘤體積繪制生長(zhǎng)曲線，飼養(yǎng)42天后，處死裸鼠，取出腫瘤稱重、4％甲醛固定后進(jìn)行病理鑒定。<

8、br>　　 8.統(tǒng)計(jì)分析
　　 各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。滿足正態(tài)分布且方差齊同的兩組間miRNA表達(dá)差異的比較，采用兩組獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；三組以上的比較采用方差分析，組間兩兩比較方差齊同時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)。不滿足正態(tài)分布時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。顯著性水平a=0.05。
　　 結(jié)果:
　　 1.16HBE-T細(xì)胞中miR-106a和miR-17-5p過表達(dá)
　　 1

9、6HBE-T細(xì)胞中的miR-106a成熟體和miR-17-5p成熟體表達(dá)水平分別是16HBE-N的2.9±0.2倍和2.3±0.1倍（P<0.05）。
　　 2.1 6HBE-T細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miRNA表達(dá)改變
　　 與16HBE-T相比，轉(zhuǎn)染miR-106a抑制劑或模擬物后miR-106a表達(dá)水平分別為0.3±0.1和1.9±0.3倍（P<0.05），轉(zhuǎn)染miR-17-5p抑制劑或模擬物后miR-17-5p表達(dá)水平分別為0

10、.4±0.1和1.7±0.2倍（P<0.05）。
　　 3.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期分布改變
　　 與inhibitor NC組比較，anti-miR-106a組和anti-miR-17-5p組均出現(xiàn)G0/G1期細(xì)胞比例增多、S期細(xì)胞比例減少（P<0.05）。與mimic NC組比較，轉(zhuǎn)染miR-106a mimic后G0/G1期細(xì)胞比例減少，S期細(xì)胞比例增多（P<0.05）。
　　 4.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力改變
　　

11、 與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-106a抑制劑或模擬物后細(xì)胞的增殖能力分別降低了0.37±0.01和升高了0.45±0.07倍（P<0.05），轉(zhuǎn)染miR-17-5p抑制劑或模擬物后細(xì)胞增殖能力分別降低了0.29±0.03倍和升高了0.34±0.02倍（P<0.05）。
　　 5.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率改變
　　 抑制劑試驗(yàn)組比抑制劑對(duì)照組出現(xiàn)更高的凋亡率（P<0.05），而各陰性對(duì)照組與未轉(zhuǎn)染組相比，凋亡率差別。同時(shí)，模擬物試

12、驗(yàn)組與模擬物對(duì)照組相比凋亡率大幅下降（P<0.05）。
　　 6.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞集落形成率改變
　　 抑制劑試驗(yàn)組比抑制劑對(duì)照組和未處理組細(xì)胞出現(xiàn)更少的克隆數(shù)（P<0.05）。而模擬物試驗(yàn)組與模擬物對(duì)照組相比克隆數(shù)增多（P<0.05）。
　　 7.裸鼠實(shí)驗(yàn)
　　 在6種處理組中，anti-miR-106a組的腫瘤生長(zhǎng)速度最慢（P<0.05），miR-106a mimic組的腫瘤生長(zhǎng)速度最快（P<0.05），而

13、16HBE-T組、Lipo-2000 NC組、inhibitor NC組、mimic NC組的腫瘤生長(zhǎng)速度無明顯差別。接種42天后收獲腫瘤，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，anti-miR-106a組的腫瘤平均重量(35.7±9.6mg)明顯低于inhibitor NC組的腫瘤平均重量 (110.8±15.3 mg)(P<0.05)。miR-106a mimic組的腫瘤平均重量(340.4±23.1 mg) 明顯高于mimic NC組的腫瘤平均重量(127.

14、6±21.9 mg)(P<0.05)。經(jīng)病理學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)，注射此6種細(xì)胞的小鼠均生長(zhǎng)出鱗狀細(xì)胞癌。
　　 結(jié)論:
　　 1．Anti-BPDE誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化的人支氣管上皮細(xì)胞16HBE-T存在miR-106a和miR-17-5p成熟體表達(dá)上調(diào)。
　　 2．miR-106a和miR-17-5p成熟體表達(dá)水平改變能夠影響16HBE-T細(xì)胞生物學(xué)特性。
　　 3．miR-106a和miR-17-5p在環(huán)境化學(xué)致癌劑