反式二羥環(huán)氧苯并芘誘導(dǎo)惡變細(xì)胞中miR-494和miR-22對(duì)PTEN基因調(diào)控及其功能研究.pdf

1、背景與目的:苯并（a）芘（B[a]P）是一種常見的環(huán)境污染物，廣泛存在于燃煤和吸煙過程中，是一種間接致癌物。流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)研究提示B[a]P暴露與人類肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。PTEN抑癌基因的失活與人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。microRNA（miRNA）是最近發(fā)現(xiàn)的一類在多物種間高度保守、對(duì)基因具有負(fù)調(diào)控作用的非編碼小分子RNA。最近研究發(fā)現(xiàn)，人類腫瘤中miRNA的異常表達(dá)常伴隨著基因表達(dá)的異常改變。本研究利用B[a]P的代謝衍生物反式-

2、7，8-二羥-9，10-環(huán)氧苯并芘（anti-BPDE）誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化第30代人支氣管上皮細(xì)胞（16HBE-T30）及其前期第15代細(xì)胞（16HBE-T15）為模型，分析microRNA-494（miR-494）和microRNA-22（miR-22）的表達(dá)，并利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)得到其共同的靶基因PTEN。通過miRNA過表達(dá)和抑制表達(dá)處理模型細(xì)胞，檢測(cè)PTEN相應(yīng)的表達(dá)改變，并利用報(bào)告基因證實(shí)作用靶序列。同時(shí)進(jìn)一步研究了miRNA

3、在致癌過程中的功能。本研究闡明了miRNA在B[a]P誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的作用及其對(duì)PTEN基因的調(diào)控行為，為肺癌的基因治療和預(yù)防提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)。 方法: 1.生物信息學(xué)預(yù)測(cè)利用TargetScan、Pictar和RNAhybrid等miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件和網(wǎng)站，對(duì)可能作用于PTEN3’端非翻譯區(qū)（3’UTR）的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。 2.miRNA和PTEN表達(dá)水平的檢測(cè)用SYBR Green定

4、量RT-PCR檢測(cè)經(jīng)anti-BPDE惡性轉(zhuǎn)化人支氣管上皮細(xì)胞（16HBE-T30）及其前期第15代細(xì)胞（16HBE-T15），以及相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞（16HBE-N30和16HBE-N15）中miR-494、miR-22成熟體和PTEN基因在mRNA水平的表達(dá)改變。對(duì)PTEN基因在蛋白水平的表達(dá)改變則利用Western blot檢測(cè)。 3.miRNA前體分子和抑制劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染按照siPORTTM NeoFXTM說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。前體轉(zhuǎn)

5、染組設(shè)實(shí)驗(yàn)組（pre-miR-494和pre-miR-22）和陰性對(duì)照組（pre-miR-nc），抑制劑組設(shè)實(shí)驗(yàn)組（anti-miR-494和anti-miR-22）和陰性對(duì)照組（anti-miR-nc）。24h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，72h后檢測(cè)miRNA和PTEN表達(dá)改變情況。 4.報(bào)告基因構(gòu)建及雙螢光素酶活力檢測(cè)將含有野生型或突變型miRNA作用靶點(diǎn)的片段分別插入到pLG3載體的螢光素酶下游3’UTR中，重組后的載體分別命名為WT

6、和MT，經(jīng)EcoRⅠ酶切鑒定并測(cè)序驗(yàn)證。用雙螢光報(bào)告檢測(cè)試劑盒進(jìn)行螢光素酶活力檢測(cè)，WT和MT均設(shè)有抑制劑處理組和陰性對(duì)照組及前體處理組和陰性對(duì)照組。采用Lipofectamin2000將RNA寡核苷酸與質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染，用pRL-TK海腎螢光素酶對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。 5.細(xì)胞凋亡檢測(cè)96孔板中進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，用ApoONE Homogeneous Caspase-3/7試劑盒，按說明操作，對(duì)各處理組細(xì)胞中Caspase

7、-3/7活力進(jìn)行檢測(cè)，以陰性對(duì)照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。Hoechst33258細(xì)胞核DNA片段染色，6孔板中轉(zhuǎn)染細(xì)胞60h后，無(wú)血清培養(yǎng)12h誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，4％福爾馬林室溫固定，PBS沖洗后進(jìn)行Hoechst33258染色，熒光顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。 6.軟瓊脂實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞集落形成率在6孔板中，每孔中加入底層瓊脂，冷卻30min后，再加入含1000個(gè)細(xì)胞的2ml頂層瓊脂，待其凝固后，置于37℃CO2溫箱中培養(yǎng)14d，觀察并計(jì)數(shù)集

8、落形成率。 7.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后接種到24孔板，待其長(zhǎng)至完全融合。用小吸頭在平板上進(jìn)行劃線，再以無(wú)血清培養(yǎng)基將脫落的細(xì)胞沖洗干凈，37℃培養(yǎng)24h后，顯微鏡下拍照。 8.統(tǒng)計(jì)分析各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)按均數(shù)4-標(biāo)注差（x±s）表示，并根據(jù)資料的性質(zhì)利用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分別進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。P<0.05為有顯著性差異。 結(jié)果 1.生物信息學(xué)分析運(yùn)用生物信息學(xué)軟件分析表明，在PTEN3’UTR中

9、存在miR-494和miR-22的3個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，miRNA與靶點(diǎn)之間的自由能絕對(duì)值較高，且靶序列在多物種間高度保守。 2.16HBE-T15和16HBE-T30細(xì)胞中miRNA和PTEN的表達(dá)16HBE-T30細(xì)胞中，miR-494、miR-22表達(dá)水平分別是16HBE-N30的12.6±1.7倍和2.3±0.1倍（P<0.05）；而在16HBE-T15細(xì)胞中，miR-494和miR-22表達(dá)水平分別是16HBE-N15的0

10、.34±0.1倍和0.62±0.1倍（P<0.05）。定量RT-PCR檢測(cè)PTENmRNA的表達(dá)改變沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），而Western blot分析16HBE-T30中PTEN蛋白表達(dá)是16HBE-N30的0.60±0.1倍（P<0.05），但16HBE-T15細(xì)胞的PTEN蛋白表達(dá)與16HBE-N15的比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。miRNA表達(dá)與PTEN蛋白表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。 3.miRNA干擾后PTE

11、N蛋白的表達(dá)改變轉(zhuǎn)染抑制劑或miRNA前體72h后，抑制劑組的miRNA表達(dá)均呈下降趨勢(shì)，而前體組呈上升趨勢(shì)。相反，在miR-494和miR-22抑制劑處理組細(xì)胞中，PTEN蛋白分別上升0.27±0.1倍和0.48±0.02倍（P<0.05）；在miR-494和miR-22前體處理組細(xì)胞中，PTEN蛋白分別下降0.16±0.09倍和0.48±0.1倍（P<0.05）。 4.雙報(bào)告基因檢測(cè)確認(rèn)miRNA靶基因重組載體經(jīng)酶切和測(cè)序鑒

12、定驗(yàn)證后，確認(rèn)為目的重組載體。（1）不對(duì)miRNA進(jìn)行干擾，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T載體的16HBE-T30組的標(biāo)化螢光素酶值比16HBE-N30的低，同時(shí)也比轉(zhuǎn)染MT載體組的低（P<0.05）。（2）對(duì)miRNA進(jìn)行干擾，轉(zhuǎn)染W(wǎng)T載體的抑制劑干擾組中，anti-miR-494組、anti-miR-22組和anti-miR-nc組的標(biāo)化螢光素酶值分別為18.3％±1.1％、20.4％±0.9％和12.8％±0.5％，前二者均比后者高（P<0.05）；轉(zhuǎn)

13、染MT載體的抑制組中3組間的標(biāo)化螢光素酶值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），但3組的標(biāo)化螢光素酶值均比轉(zhuǎn)染W(wǎng)T載體組中anti-miR-nc組的值高（P<0.05）。WT載體的前體干擾組中，pre-miR-494組、pre-miR-22組和pre-miR-nc組的標(biāo)化螢光素酶值分別為6.4％±0.3％、5.8％±0.8％和10.8％±0.6％，前二者均比后者低（P<0.05）；轉(zhuǎn)染MT載體的前體組中3組間的標(biāo)化螢光素酶值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0

14、.05），而3組的螢光素值均比轉(zhuǎn)染W(wǎng)T組中的pre-miR-nc的值高（P>0.05）。說明miR-494和miR-22對(duì)PTEN的調(diào)控作用是通過其靶點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)的，作用靶點(diǎn)種子序列的突變可以使PTEN逃避miR-494和miR-22的調(diào)控。 5.miR-494和miR-22參與細(xì)胞凋亡過程在16HBE-T30細(xì)胞中，抑制劑處理顯示，轉(zhuǎn)染anti-miR-494和anti-miR-22細(xì)胞的Caspase-3/7的活力比anti-m

15、iR-nc組的高，分別上升0.6±0.2和0.5±0.1倍（P<0.05）。前體組顯示，轉(zhuǎn)染pre-miR-494和pre-miR-22細(xì)胞的Caspase-3/7的活力分別是pre-miR-nc的0.82±0.03倍和0.84±0.05倍（P<0.05）。在16HBE-N30細(xì)胞中，pre-miR-494組（0.73±0.10倍）與pre-miR-22組（0.87±0.02倍）低于pre-miR-nc組（P<0.05）。Hoechst

16、33258 DNA片段染色顯示，在16HBE-T30細(xì)胞中抑制miR-494和miR-22的表達(dá)能增加細(xì)胞凋亡比例。 6.miRNA干擾后細(xì)胞集落形成率的改變anti-miR-494（5.9％±0.9％）和anti-miR-22（6.2％±1.1％）處理的16HBE-T30細(xì)胞與其陰性對(duì)照處理細(xì)胞（11.6％±0.9％）比較，集落形成率均明顯降低（P<0.05）。 7.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) anti-miR-494（50.6％±

17、1.5％）和anti-miR-22（74.8％±2.5％）處理的16HBE-T30（93.9％±4.4％）細(xì)胞與其陰性對(duì)照處理細(xì)胞比較，生長(zhǎng)細(xì)胞覆蓋率均明顯減少（P<0.05），說明細(xì)胞泳動(dòng)能力明顯降低。 結(jié)論 1.anti-BPDE誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化存在早期階段miR-494和miR-22成熟體表達(dá)下調(diào)，而晚期階段表達(dá)明顯上調(diào)的現(xiàn)象；而這兩個(gè)階段PTEN蛋白的表達(dá)與miRNA表達(dá)成相反的趨勢(shì)，晚期明顯下調(diào)。

18、 2.PTEN基因是miR-494和miR-22的靶基因，后二者通過前者的3個(gè)靶序列而發(fā)揮它們的調(diào)控作用，miR-494和miR-22的表達(dá)沉默或PTEN靶序列的突變可以終止它們對(duì)PTEN的調(diào)控作用。 3.miR-494和miR-22在細(xì)胞惡變中具有重要作用，是兩個(gè)小分子原癌基因，能抑制細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞惡性程度。 本項(xiàng)目創(chuàng)新性：發(fā)現(xiàn)了miR-494和miR-22的腫瘤學(xué)意義，并揭示了這兩個(gè)miRNA對(duì)PTEN基因