反式二羥環(huán)氧苯并（a）芘高表達(dá)相關(guān)基因及其主要特性研究.pdf

1、苯并(a)芘(B[a]P)是一種廣泛存在的環(huán)境污染物，系多環(huán)芳烴(PAHs)的代表物，在空氣、土壤、水及食物中均有它的存在。PAHs由有機(jī)物質(zhì)的高溫分解和不完全燃燒形成，也可由人類生產(chǎn)和生活活動(dòng)產(chǎn)生以及自然生成。PAHs進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后活化為高毒性的活性代謝中間物并可對(duì)細(xì)胞大分子(DNA，蛋白質(zhì)，脂質(zhì))造成不可逆的損傷。PAHs代表一類有毒化合物，能在體內(nèi)產(chǎn)生許多毒性反應(yīng)，包括細(xì)胞毒性、遺傳毒性、免疫毒性、致畸性、致癌性和神經(jīng)毒性等。

2、關(guān)于BaP的致癌性資料，主要來(lái)自流行病學(xué)研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，但人類方面尚缺乏有力的證據(jù)，因此，在WHO屬下的國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)在其公布的致癌因素清單中，將之歸入“對(duì)人類可能有致癌性”的一類因素中。故BaP對(duì)人類致癌性的證據(jù)有待充實(shí)，其致癌機(jī)制尤其是分子機(jī)制有待闡明。已知Bap可使某些原癌基因激活和抑癌基因失活，但這些變化并不具特異性，因?yàn)椴簧倩瘜W(xué)物質(zhì)對(duì)這些基因都具有類似作用，因而難以闡明BaP致癌代謝物BPDE的特異易感基因。因此，本文在

3、從基因組水平上的篩選→已知基因功能研究→未知基因全長(zhǎng)克隆等方面對(duì)BPDE致癌的相關(guān)基因進(jìn)行研究，為尋找環(huán)境致癌物的生物性標(biāo)志提供依據(jù)，為腫瘤的基因預(yù)防、早期診斷提供理論與技術(shù)基礎(chǔ)，為探索抗腫瘤分子生物學(xué)治療手段提供新的策略與途徑?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下： 本文有三部分組成：第一部分反式二羥環(huán)氧苯并(a)芘誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和成瘤16HBE細(xì)胞基因的表達(dá)改變 目的：多環(huán)芳烴是環(huán)境中廣泛存在的污染物，苯并(a)芘(B[a]P)一直作為致癌

4、劑多環(huán)芳烴(PAH)的代表，反式-7，8-二羥-9，10-環(huán)氧苯并芘(反式-BPDE)可能是B[a]P的終致突變物和終致癌物，盡管己進(jìn)行過(guò)一些研究，但其致癌的分子機(jī)制特別是相關(guān)敏感基因的研究仍不十分清楚，本研究以篩選反式-BPDE誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞以及成瘤16HBE細(xì)胞的差異表達(dá)基因，為其致癌的分子機(jī)制研究及生物性標(biāo)志的篩選提供依據(jù)。 方法：分別以BPDE轉(zhuǎn)化和成瘤16HBE細(xì)胞cDNA為檢測(cè)子(tester)，正常16HB

5、E細(xì)胞cDNA為驅(qū)動(dòng)子(driver)，應(yīng)用抑制性消減雜交方法構(gòu)建cDNA消減文庫(kù)，經(jīng)2次消減雜交和2次PCR后，將巢式PCR產(chǎn)物插入TA載體克隆，隨機(jī)挑選克隆進(jìn)行鑒定和測(cè)序，并用斑點(diǎn)雜交法驗(yàn)證序列的同源性，將所得序列進(jìn)行GenBank的BLAST和生物信息學(xué)分析。 結(jié)果：抑制性消減雜交試驗(yàn)結(jié)果的電泳圖顯示消減組有明顯的條帶富集，未消減組看不到明顯的條帶，說(shuō)明消減組有差異表達(dá)基因被擴(kuò)增。將這些差異表達(dá)的基因克隆、測(cè)序、分析后，在

6、BPDE轉(zhuǎn)化細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了7個(gè)高表達(dá)的基因，為翻譯延長(zhǎng)因子1α1、線粒體基因、溶解物載體家族25、EphA2、酪氨酸-3-加單氧酶/色氨酸-5-加單氧酶活化蛋白、乳酸脫氫酶A、TRIM28等，尚有一條在GenBank的已知基因中找不到對(duì)應(yīng)序列，在EST序列中找到全長(zhǎng)對(duì)應(yīng)序列；在成瘤細(xì)胞中有8條已知的基因高表達(dá)，它們是：真核生物翻譯延長(zhǎng)因子1α1，HIF-1反應(yīng)性RTP801，核糖體蛋白L10(RPL10)，核糖體蛋白S29(RPS29)，

7、線粒體相關(guān)的幾個(gè)基因，層粘連蛋白受體1(67LR1)，其一致性均達(dá)到99％以上；另有2條差異表達(dá)的cDNA片斷在已知基因中未找到對(duì)應(yīng)序列，在EST中找到對(duì)應(yīng)序列。 結(jié)論：初步篩選了在轉(zhuǎn)化和成瘤16HBE細(xì)胞中高表達(dá)的基因，為其功能的進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)資料；發(fā)現(xiàn)的高表達(dá)基因可能在BPDE的轉(zhuǎn)化和致癌機(jī)制中起作用，另外，可能有未知基因與BPDE的轉(zhuǎn)化和成瘤作用有關(guān)，為新基因的全長(zhǎng)克隆和功能研究提供了基礎(chǔ)資料。 第二部分反式

8、二羥環(huán)氧苯并(a)芘高表達(dá)相關(guān)基因67LR1和eTEF1α1的主要特性研究 目的：67LR1及eTEF1α1基因是在第一部分研究的基礎(chǔ)上，篩選出的與反式-BPDE相關(guān)的基因，雖然已進(jìn)行過(guò)一些研究，但其在致癌機(jī)制中所起的作用仍不清楚，本部分是為了探討67LR1及eTEF1α1基因在反式-BPDE轉(zhuǎn)化及致癌機(jī)制中的作用，為反式-BPDE相關(guān)基因的功能研究及其惡性轉(zhuǎn)化的生物性標(biāo)志的篩選提供依據(jù)。 方法：從GenBank調(diào)出67

9、LR1及eTEF1α1基因全長(zhǎng)，設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR方法擴(kuò)增67LR1和eTEF1α1基因全長(zhǎng)，插入pcDNATM3.1DirectionalTOPO表達(dá)載體，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的技術(shù)和/或G418細(xì)胞篩選法轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因67LR1和eTEF1α1的瞬時(shí)和(或)穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。用半定量RT-PCR方法分析轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物，對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因67LR1細(xì)胞株，應(yīng)用含8064個(gè)基因點(diǎn)的微芯公司基因表達(dá)譜芯片CSC-GE-

10、80與雙熒光標(biāo)記樣品與芯片雜交和掃描、圖像數(shù)據(jù)分析等一系列處理進(jìn)行表達(dá)譜分析；對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染67LR1和eTEF1α1基因的細(xì)胞株，進(jìn)行了雙層軟瓊脂試驗(yàn)，并對(duì)轉(zhuǎn)基因67LR1的細(xì)胞株進(jìn)行了裸鼠接種試驗(yàn)。 結(jié)果：成功擴(kuò)增出67LR1和eTEF1α1基因全長(zhǎng)，構(gòu)建出瞬時(shí)和(或)穩(wěn)定表達(dá)67LR1和eTEF1α1的細(xì)胞株。對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因67LR1細(xì)胞株的表達(dá)譜分析，兩組相比發(fā)生了顯著性表達(dá)變化的基因有295個(gè)，其中表現(xiàn)為上調(diào)的基因有1

11、45個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因有150個(gè)。在發(fā)生了顯著性表達(dá)改變的基因中，比較有明顯功能分類特征的包括與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因，與腫瘤相關(guān)的基因，與免疫反應(yīng)相關(guān)的基因以及與蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)相關(guān)的基因等。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染67LR1和eTEF1α1基因的細(xì)胞株，均能在雙層軟瓊脂中形成克隆。轉(zhuǎn)基因67LR1的細(xì)胞株在本次實(shí)驗(yàn)中尚不能使裸鼠成瘤。 結(jié)論：67LR1基因功能涉及到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，腫瘤相關(guān)基因等方面，相關(guān)基因的表達(dá)變化具有復(fù)雜性，復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的紊

12、亂與Ras通路有關(guān)。eTEF1α1和67LR1均與反式-BPDE的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)，提示67LR1和eTEF1α1基因作為反式-BPDE惡性轉(zhuǎn)化的生物性標(biāo)志的可能性，亦提示將67LR1和eTEF1α1作為腫瘤化學(xué)預(yù)防和治療的靶分子的可能性。 第三部分反式二羥環(huán)氧苯并(a)芘相關(guān)新基因brg的全長(zhǎng)克隆 目的：在第一部分的研究中，發(fā)現(xiàn)16HBE-C細(xì)胞表達(dá)變化的基因中有未知基因參與(EST)，因其與BPDE有關(guān)，所以命名為brg

13、(anti-BPDErelatedgene)基因。本研究應(yīng)用cDNA末端快速擴(kuò)增法(rapidamplificationofcDNAends，RACE)擴(kuò)增此未知基因的全長(zhǎng)，以進(jìn)行下一步的基因功能研究。 方法：應(yīng)用cDNA末端快速擴(kuò)增法(RACE技術(shù))，對(duì)3’和5’端分別設(shè)計(jì)了梯度PCR，巢式PCR等優(yōu)化程序，以獲得特異的產(chǎn)物，然后對(duì)特異產(chǎn)物直接測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，基因拼接等獲得新基因brg全長(zhǎng)。 結(jié)果：

14、用RACE方法，經(jīng)優(yōu)化后的程序，3’和5’端均成功獲得特異性產(chǎn)物，3’RACE測(cè)序?yàn)?94bp，有明顯的PolyA加尾信號(hào)，有編碼區(qū)的終止密碼子；5’RACE測(cè)序?yàn)?017bp，有起始密碼子ATG，其中197bp為3’和5’全長(zhǎng)共有序列。將3’和5’序列拼接，結(jié)果全長(zhǎng)1214bp，生物信息學(xué)分析brg基因閱讀框1032bp，編碼344個(gè)氨基酸。 結(jié)論：所得結(jié)果與設(shè)計(jì)一致，說(shuō)明這一技術(shù)路線是簡(jiǎn)便可行的，brg基因可能在反式二羥環(huán)氧