反式二羥環(huán)氧苯并(a)芘相關(guān)原癌基因表達(dá)及HER2-neu生物特性研究.pdf

1、苯并(a)芘(B[a]P)是一種廣泛存在的多環(huán)芳烴(PAHs)類環(huán)境污染物，主要由含碳物質(zhì)的高溫分解和不完全燃燒產(chǎn)生，它較多的存在于煤煙、香煙的煙霧、熏烤食品、汽車尾氣中。腫瘤流行病學(xué)調(diào)查及實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)B[a]P具有較強(qiáng)致癌性，它與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，尤其與人類肺癌的發(fā)生高度有關(guān)。2006年，B[a]P已被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)

2、從第二類A組“很可能對人類致癌物”改為第一類“人類致癌物”。BaP是間接致癌物，需在體內(nèi)代謝生成活性代謝終產(chǎn)物才具有強(qiáng)烈的致癌作用。BaP代謝過程復(fù)雜，可產(chǎn)生20多種氧化代謝產(chǎn)物和大量結(jié)合物，如環(huán)氧化物、酚、醌、二醇、二氫二醇、二醇環(huán)氧化物和四醇等。其中以反式二氫二醇環(huán)氧苯并(a)芘[anti-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide benzo(a)pyrene，anti-BPDE]致癌活性最強(qiáng)。Anti-BPDE具有

3、親電子性，易與蛋白質(zhì)和核酸大分子反應(yīng)，特別易于與嘌呤殘基反應(yīng)。它通過攻擊DNA親核位點(diǎn)與其共價(jià)結(jié)合形成BPDE-DNA加合物，引起DNA堿基突變，從而使癌基因和/或抑癌基因表達(dá)或功能改變，另外它還可以與蛋白質(zhì)及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，影響細(xì)胞的代謝及細(xì)胞周期的正常進(jìn)行，引起細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。盡管國內(nèi)外專家學(xué)者對BaP的致癌進(jìn)行了很多研究，但其分子機(jī)制仍不十分清楚。因此，本研究從文獻(xiàn)中搜索與人類肺癌高度相關(guān)的原癌基因，并檢測它們在反式BPDE惡性轉(zhuǎn)

4、化細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)錄及翻譯水平上表達(dá)變化→應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制癌基因HER2/neu表達(dá)→抑制HER2/neu基因表達(dá)對反式BPDE惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞生物學(xué)特性的影響進(jìn)行研究，為探索環(huán)境污染物B(a)P的致癌分子機(jī)制提供一定依據(jù)，為腫瘤的基因預(yù)防、早期診斷及治療提供理論與技術(shù)基礎(chǔ)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下： 第一部分、反式二羥環(huán)氧苯并(a)芘主要相關(guān)原癌基因表達(dá)研究 目的：苯并(a)芘(B[a]P)作為廣泛存在的一種典型的多環(huán)芳烴類環(huán)

5、境污染物，研究證明它具有致癌性，與人類肺癌發(fā)生密切相關(guān)。反式-7,8-二羥-9,10-環(huán)氧苯并芘(反式-BPDE)是B[a]P體內(nèi)代謝的終致癌產(chǎn)物，盡管已進(jìn)行過一些研究，但其致癌的分子機(jī)制特別是相關(guān)原癌基因的研究仍不十分清楚，本研究通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)在人類肺癌中高表達(dá)的原癌基因，通過QRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測這些原癌基因在反式-BPDE誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞中表達(dá)變化，為其致癌的分子機(jī)制研究及生物學(xué)標(biāo)志的篩選提供一定

6、資料。 方法：通過國內(nèi)外文獻(xiàn)檢索分析與人類肺癌高度相關(guān)的表達(dá)增高的4條原癌基因，找出可能與環(huán)境污染物苯并(a)芘密切相關(guān)的癌基因。分別提取反式BPDE惡性轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞（16HBE-T）與溶劑DMSO對照組細(xì)胞（16HBE-N）的總RNA和總蛋白，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR方法和Western blot的方法，分別檢測HER2/neu，c-myc，cyclin D1和K-ras癌基因相應(yīng)mRNA和蛋白表達(dá)水平，并用細(xì)胞免疫化學(xué)

7、方法驗(yàn)證蛋白表達(dá)水平改變及檢測各蛋白表達(dá)定位。 結(jié)果：RT-PCR和QRT-PCR試驗(yàn)結(jié)果均顯示16HBE-T與16HBE-N兩組間HER2/neu、c-myc、cyclin D1、K-ras癌基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平存在有差異。再經(jīng)蛋白水平檢測分析驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在BPDE轉(zhuǎn)化細(xì)胞中這些癌基因亦存在蛋白水平高表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)分析蛋白表達(dá)定位無異常變化。 結(jié)論：初步篩選了在反式BPDE惡性轉(zhuǎn)化16HBE細(xì)胞中表達(dá)增高的原癌基因

8、，發(fā)現(xiàn)這些原癌基因激活可能是反式BPDE致癌分子機(jī)制之一。為進(jìn)一步研究環(huán)境污染物苯并(a)芘導(dǎo)致人類肺癌發(fā)生提供一些基礎(chǔ)的資料。 第二部分、抑制反式二羥環(huán)氧苯并(a)芘高表達(dá)原癌基因HER2/neu的研究 目的：HER2/neu基因是在第一部分研究的基礎(chǔ)上，確認(rèn)出的與反式BPDE誘導(dǎo)16HBE惡變細(xì)胞有關(guān)的重要的高表達(dá)原癌基因。雖然在其他一些腫瘤細(xì)胞中對HER2/neu基因已進(jìn)行了一些研究，但其在BPDE致癌機(jī)制中所起的

9、作用卻不清楚。本部分是為了探討HER2/neu基因在反式BPDE惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞及其致癌機(jī)制中的作用，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)建立較穩(wěn)定的特異性抑制反式BPDE惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中HER2/neu基因表達(dá)的細(xì)胞。 方法：從GenBank調(diào)出HER2/neu基因全長，應(yīng)用生物信息學(xué)知識設(shè)計(jì)三條RNA干擾的特異性有效靶序列，采用化學(xué)合成方法得到HER2/neu 小分子干擾RNA(siRNA)，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染介導(dǎo)技術(shù)轉(zhuǎn)染16HBE-T細(xì)胞，用逆轉(zhuǎn)錄熒

10、光定量PCR方法和Western blot技術(shù)分析瞬時轉(zhuǎn)染HER2/neu siRNAs后HER2/neu表達(dá)抑制水平。篩選出siRNA有效靶序列后，再通過構(gòu)建pSIREN-RetroQ-neu逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)HER2/neu shRNA載體，轉(zhuǎn)染RetroPackTM PT67細(xì)胞后產(chǎn)生的攜帶HER2/neu shRNA病毒顆粒感染16HBE-T細(xì)胞。再經(jīng)嘌呤霉素培養(yǎng)篩選得到穩(wěn)定的細(xì)胞克隆株。 結(jié)果：成功應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制了

11、16HBE-T細(xì)胞中HER2/neu基因表達(dá)，并構(gòu)建了HER2/neu shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒真核表達(dá)載體，利用RetroPackTM PT67包裝細(xì)胞產(chǎn)生攜帶HER2/neu shRNA病毒顆粒感染16HBE-T細(xì)胞，建立穩(wěn)定抑制HER2/neu表達(dá)的細(xì)胞株。 結(jié)論：篩選了RNA干擾HER2/neu基因表達(dá)的特異性有效靶序列，快速建立了HER2/neu shRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒真核表達(dá)載體，并得到了穩(wěn)定抑制HER2/neu表達(dá)的細(xì)胞

12、株，為下一步研究探索HER2/neu基因在反式BPDE惡變細(xì)胞中的作用奠定基礎(chǔ)。 第三部分、抑制HER2/neu表達(dá)對反式二羥環(huán)氧苯并(a)芘惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的影響 目的：在反式BPDE惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞中利用RNA干擾技術(shù)建立HER2/neu表達(dá)抑制體系的基礎(chǔ)上進(jìn)行基因干擾后細(xì)胞生物學(xué)特性的研究，并觀察對其他相關(guān)原癌基因蛋白表達(dá)的影響。 方法：應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)、MTT方法及軟瓊脂集落實(shí)驗(yàn)分別檢測了16HBE-T經(jīng)RNA干

13、擾前后細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖活力及軟瓊脂集落形成率方面的影響。應(yīng)用Western blot方法檢測了應(yīng)用兩個不同有效靶位點(diǎn)的siRNA干擾抑制HER2/neu表達(dá)后的c-myc和cyclin D1蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果：HER2/neu表達(dá)抑制的細(xì)胞中出現(xiàn)G0/G1期阻滯，并伴隨S期細(xì)胞周期比例下降。穩(wěn)定抑制HER2/neu表達(dá)細(xì)胞株(HBE-T-neu)中細(xì)胞增殖活力比干擾對照組細(xì)胞HBE-T-N和16HBE-T明顯下降